$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ustawianie mikroskopu i pozyskanie w czasie poklatkowym
UWAGA: Opisany tutaj protokół został opracowany dla mikroskopu szerokokątnego odwróconego z autofocusem, obiektywu olejowego PH3 100X/1.30 NA, motoryzowanego stopnia X, Y, aparatu sCMOS, źródła światła, filtrów dla białek zielono-fluorescencyjnego, czerwonofluorescencyjnych lub żółtofluorescencyjnych oraz komory inkubacyjnej o kontrolowaniu temperatury. Ta komora chroni komórki przed światłem i utrzymuje stałą temperaturę.
- Podgrzej komorę inkubacyjną i mikroskop do 32 °C przez ~1 - 2 godziny przed rozpoczęciem mikroskopii.
UWAGA: W zależności od ustawienia mikroskopu, ogrzewanie może trwać dłużej. Podgrzewanie jest niezbędne, aby zmniejszyć dryf i stabilizować system sterowania autofocusem. - Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Wybierz odpowiedni obiektyw oraz odpowiednie lustra i filtry, aby uzyskać obrazy z kontrastem fazowym oraz obrazy białek zielonofluorescencyjnych, czerwonofluorescencyjnych lub żółtofluorescencji.
UWAGA: Mikroskop jest zazwyczaj dostarczany z preferowanym oprogramowaniem do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu. Tutaj użyto komercyjnie dostępnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów) do sterowania mikroskopem i akwizycją obrazów. - Dodaj kroplę wysokiej jakości oleju immersyjnego do soczewki obiektywu i na dno próbki, wstępnie inkubowanej w 32 °C. Umieść obiektyw w najniższej możliwej pozycji Z, aby nie uszkodzić go podczas umieszczenia próbki na stole mikroskopu. Umieść metalową ramę z próbką na stole mikroskopowym, tak że "strona otworu" jest skierowana w stronę obiektywu. Przymocuj próbkę mocno w uchwytie na scenę.
- Skup się na komórkach, przesuwając scenę w kierunku Z bliżej celu. Przesuwaj stopień powoli, gdy olej spadnie na dolną stronę próbki i obiektyw nawiąże kontakt. Przesuwaj stopień w kierunku X/Y, aż w obszarze widzenia pojawi się wiele pojedynczych komórek, gdy komórki znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej. Upewnij się, że przynajmniej jedna fluorescencja mikrosfera znajduje się w tym obszarze widzenia, aby później wyrównać uzyskane obrazy.
UWAGA: W optymalnych warunkach należy osiągnąć gęstość komórek 15–30 komórek na obszar widzenia (2 048 x 2 048 pikseli lub 133,1 x 133,1 μm). - Otwórz czarodzieja Multi-Dimensional Acquisition w oprogramowaniu sterowania mikroskopem, aby skonfigurować eksperyment poklatkowy, który pozwala mikroskopowi na zbieranie obrazów na różnych długościach fali i pozycjach etapów, jeśli jest to konieczne.
- W zakładce głównej aktywuj Timelapse i Multiple Wavelengths. Dodatkowe zakładki pojawią się po lewej stronie okna.
- Kliknij zakładkę Zapisywanie i wybierz Katalog , aby wybrać pusty folder na dysku twardym komputera i zapisać pozyskane obrazy. Aktywuj nazwę bazową Increment, jeśli plik istnieje , aby upewnić się, że kolejne zbiory danych nie nadpisują wcześniejszych. Następnie nadaj eksperymentowi nazwę wraz z datą oraz nazwą szczepu lub tytułem eksperymentu.
- Kliknij zakładkę Time-lapse , aby dostosować parametry time-lapse. Ustaw czas trwania na 24 godziny, a interwał czasu na 20 minut. Liczba punktów czasu zmienia się automatycznie.
UWAGA: Optymalny przedział czasowy zależy od eksperymentu oraz funkcji komórkowej, którą ma się analizować. Częste akwizycje obrazów mogą powodować fotoblajch. Dlatego empirycznie należy znaleźć kompromis między rozdzielczością czasową a fotobieleniem. W czasie podwojenia 4–6 godzin obrazy można łatwo uzyskać w odstępie 5 minut (lub nawet krótszym, jeśli jest to pożądane) do mikroskopii z kontrastem fazowym. Jeśli pożądana jest mikroskopia fluorescencyjna w ciągu 24 godzin, należy rejestrować obrazy w odstępach około 15–30 minut. - Kliknij zakładkę Długości fal. Wybierz liczbę długości fal, które należy uzyskać dla każdego obrazu w każdym punkcie czasowym, zmieniając tę liczbę.
UWAGA: Dla każdej długości fali pojawi się nowa zakładka po lewej stronie czarodzieja "Wielowymiarowe Akwizycje", a długości fal będą pobierane w kolejności od góry do dołu. Dla każdej długości fali ustawienia akwizycji można modyfikować osobno. - Kliknij pierwszą zakładkę długości fali od góry. Wybierz kontrast fazowy w rozwijanej liście Oświetlenie . Wybierz 100 ms dla ekspozycji i wybierz Każdy punkt czasu w rozwijanej liście Pozyskiwanie . Wyłącz Auto Expoe, wybierając Nigdy w rozwijanej liście.
- Powtórz krok 3.5.5 dla każdej długości fali, którą trzeba uzyskać w każdym punkcie czasowym. Dla eksperymentalnego zestawu i białek oznaczonych fluorescencją opisanych tutaj, należy stosować następujące parametry ekspozycji: 250 ms dla białek fuzji mCherry, 200 ms dla białek fuzji YFP (Żółte białko fluorescencyjne) oraz 1000 ms dla białek fuzji GFP (Green Fluorescent Protein).
UWAGA: Optymalne ustawienia oświetlenia dla każdego szczepu i białka fluorescencyjnego należy określić z góry, zmieniając natężenie lampy oraz czas akwizycji obrazu dla każdej długości fali. Zbyt długie czasy na przechwytywanie obrazu zwiększają efekt fototoksyczny i ostatecznie prowadzą do zatrzymania wzrostu oraz śmierci komórek. Dlatego należy osiągnąć kompromis między jakością obrazu a żywotnością komórek. - Pobieraj obrazy z różnych pozycji etapów, aby zwiększyć liczbę komórek zarejestrowanych w tym samym eksperymencie.
- Aby uzyskać zdjęcia z wielu pozycji etapu, aktywuj Wiele pozycji etapu w zakładce Główny. Następnie kliknij zakładkę Stage i kliknij przycisk Live , aby zobaczyć pole widzenia.
- Przesuń stopień w kierunku X/Y, aż obszar zainteresowania (ROI) znajdzie się w polu widzenia. Zapisz współrzędne X i Y, klikając "+" w zakładce Etap . Przesuń etap ponownie w kierunku X/Y, aż znajdziesz nowy zwrot z inwestycji, a następnie zapisz współrzędne, klikając "+". Idź dalej, aż zostanie zapisana pożądana liczba regionów.
UWAGA: W przypadku pobierania zdjęć fluorescencyjnych upewnij się, że obszary zainteresowania (ROI) nie znajdują się zbyt blisko siebie, aby zminimalizować fototoksyczność.
- Sprawdź jeszcze raz, czy komórki są ostre, klikając na różne zapisane pozycje X i Y oraz rozpocznij sprzętowy autofokus, klikając AFC hold , aby zachować stałą pozycję Z przez cały eksperyment.
- Rozpocznij nagrania time-lapse w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, klikając Acquire w kreatorze Multi-Dimensional Acquisition .
UWAGA: Dla każdej zdobytej długości fali pojawi się jedno okno, a dodatkowe okno pokazuje liczbę zdobytych punktów czasu oraz czas do następnego pozyskania obrazu. - Sprawdź, czy komórki są nadal ostre po pierwszych kilku punktach czasowych nagrań poklatkowych, aby zmaksymalizować jakość zdjęć, i w razie potrzeby ponownie się ustawić.