Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Streszczenie

Źródło: Schumacher, D., i Sogaard-Andersen, L. Obrazowanie żywymi komórkowymi fluorescencji pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje wykorzystanie obrazowania żywych komórek do śledzenia pochodzenia chromosomów oznaczonych fluorescencją podczas podziału komórek bakteryjnych. Rejestruje dynamikę segregacji chromosomów za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej oraz fluorescencji.

Protokół

1. Ustawianie mikroskopu i pozyskanie w czasie poklatkowym

UWAGA: Opisany tutaj protokół został opracowany dla mikroskopu szerokokątnego odwróconego z autofocusem, obiektywu olejowego PH3 100X/1.30 NA, motoryzowanego stopnia X, Y, aparatu sCMOS, źródła światła, filtrów dla białek zielono-fluorescencyjnego, czerwonofluorescencyjnych lub żółtofluorescencyjnych oraz komory inkubacyjnej o kontrolowaniu temperatury. Ta komora chroni komórki przed światłem i utrzymuje stałą temperaturę.

1. Podgrzej komorę inkubacyjną i mikroskop do 32 °C przez ~1 - 2 godziny przed rozpoczęciem mikroskopii.
   UWAGA: W zależności od ustawienia mi....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMI6000B z AFC	Mikrosystemy Leica	11888945	Zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny z odwróconym polem z adaptacyjnym systemem ostrości
Uniwersalna rama montażowa	Mikrosystemy Leica	11532338	Uchwyt na etap dla różnych rozmiarów próbek
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 OLEJ PH3	Mikrosystemy Leica	11506197	Cel kontrastu fazowego
Aparat Orca Flash 4.0	Hamamatsu	11532952	Kamera sCMOS o rozdzielczości 4,0 megapiksela do akwizycji obrazu
Zestaw filtrów TXR ET, k	Mikrosystemy Leica	11504170	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, np. 560/40 Em: 645/75
Zestaw filtrów L5 ET, k	Mikrosystemy Leica	11504166	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, np.: 480/40 Em: 527/30
Zestaw filtrów YFP ET, k	Mikrosystemy Leica	11504165	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, np.: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Prior	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Automatyzacja mikroskopu z interaktywnym centrum sterowania
Źródło światła EL 6000	Mikrosystemy Leica	11504115	Zewnętrzne źródło światła fluorescencyjnego
Inkubator BLX Black	Pecon	11532830	komora inkubacyjna otaczająca mikroskop
Tempcontrol 37-2 cyfrowy	Mikrosystemy Leica	11521719	Automatyczna regulacja temperatury dla komory inkubacyjnej
Filtropur BT25 0.2 filtr na wierzch butelki	Sarstedt	831,822,101	Filtr na pokrywce butelek do sterylizacji buforów
Deckgläser	VWR	630-1592	Szklana pokrywa (60 x 22 mm, grubość: 0,7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agaroza do preparatów mikroskopowych
Leica Metamorph AF	Mikrosystemy Leica	11640901	Oprogramowanie do sterowania mikroskopem i oprogramowanie do analizy obrazów
Tetraspeck Microsperes, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Fluorescencyjne mikrosfery