Obrazowanie czasowe z żywymi komórkami drapieżnictwa bakterioworu Bdellovibrio na E. coli

Streszczenie

Źródło: Makowski, Ł., i in. Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życia bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne Bdellovibrio bacteriovorus polującego na unieruchomionej E. coli pod agarozową poduszką, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym replikacji wewnątrzkomórkowej i uwalniania potomstwa do badania drapieżnictwa bakteryjnego i interakcji żywioł-patogen.

Protokół

1. Przewodzenie mikroskopii poklatkowej fluorescencji

1. Umieść antenę o średnicy 35 mm w uchwycie na szalkę Petriego tak, aby nie poruszała się podczas eksperymentu. Na obiektyw oraz dno naczynia o średnicy 35 mm nałóż jedną kroplę oleju immersyjnego (współczynnik załamania światła) oraz dno.
2. Zamontuj uchwyt na stole mikroskopu odwróconego w komorze mikroskopu.
3. Ustaw opcje w oprogramowaniu sterowania mikroskopem, aby zbierać wiele obrazów na różnych pozycjach etapów w czasie.
   1. Ustaw powiększenie (100x) i soczewkę polichromową (GFP (zielone białko fluorescencyjne)/mCherry). Używając okularu i jasnego pola (BF), znajdź płaszczyznę ogniskową i otwórz menedżera listy punktów.
   2. Wybierz co najmniej 10 interesujących miejsc, przesuwając scenę i zapisując współrzędne każdej pozycji w oprogramowaniu mikroskopu, klikając przycisk Oznacz punkt . Unikaj pozycji blisko siebie, aby zapobiec fotobieleniu i fototoksyczności. Obróć zawór kamery od okularu do monitora i kalibruj każdy punkt, ustawiając płaszczyznę ogniskową i klikając przycisk Zamień punkt w menedżerze listy.
   3. Otwórz projektant eksperymentu i ustaw wszystkie parametry eksperymentalne w każdej zakładce w następujący sposób:
      1. Odznacz pudełko do układania Z .
      2. Wybierz kanały fluorescencyjne i ustaw optymalne ustawienia oświetlenia. Tutaj zastosowano następujące ustawienia: dla kanału mCherry zestawy filtrów mCherry (EX575/25; EM625/45), 50% intensywności i czas ekspozycji 200 ms; dla kanału GFP zestaw filtrów GFP (EX475/28; EM525/48), intensywność 50% i 80 ms; a dla obrazów BF – kanał POL, 5% intensywności i 50 ms.
      3. Wybierz odstępy między pobieraniem zdjęć a całkowitym czasem eksperymentu. W tym czasie wykonywano 5-minutowe interwały przez 10-godzinny okres eksperymentu.
      4. Włącz utrzymanie ostrości dla wybranych pozycji (dla systemu używanego tutaj, oznaczając pole Utrzymuj ostrość za pomocą UltimateFocus ).
      5. Wybierz folder danych, w którym pliki obrazów powinny być automatycznie zapisane.
      6. Sprawdź ponownie wszystkie ustawienia w oprogramowaniu mikroskopu, a następnie rozpocznij eksperyment time-lapse.
4. Po pierwszej godzinie eksperymentu sprawdź, czy wszystkie pozycje na scenie są nadal ostre. Dostosuj ostrość w odstępach czasowych między akwizycją, jeśli to konieczne.
5. Po zakończeniu eksperymentu time-lapse należy usunąć szalkę Petriego i użyć miski 35 mm z agarozową podkładką zgodnie z protokołem biobezpieczeństwa.
   UWAGA: Wszystkie podkroki po kroku 1.2 są specyficzne dla użytkowników DeltaVision Elite. Badacze korzystający z innych systemów muszą dostosować ustawienia do poszczególnych systemów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CertifiedMolecular Biology Agarose	BIO-RAD	161-3100	Niskofluorescencyjna agaroza dla agarozowej podkładki
Fidżi	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Pakiet do przetwarzania obrazów open source
Szklana podstawa 35 mm	Ibidi	81218-200	Szkło niepowlekane
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Stopień mikrotiterowy, moduł laserowy ultimate focus, aparat DV Elite CoolSnap HQ2, zestaw SSI FP DV, zestaw zestawu. Olej olejowy z Oly 100x 1.4 NA, pryzmat Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Rozpocznij SoftWoRx	GE		Oprogramowanie obrazujące dostarczone przez producenta