Wizualizacja rozkładu białek bakteryjnych w trzech wymiarach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Abstract

Źródło: Bratton, B. P. i in., Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych dla dokładnych reprezentacji komórkowych i precyzyjnej lokalizacji białek. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje metodę pozyskiwania i analizowania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych komórek bakteryjnych w celu badania organizacji białek na poziomie pojedynczych komórek.

Protocol

1. Obrazowanie

1. Włóż szczelny szkiełko do mikroskopu i pozwól mu stać przez 5 minut, aby wyrównać temperaturę z otoczeniem. Pokój mikroskopu może mieć inną temperaturę niż pomieszczenie do przygotowania próbek.
2. Weź fluorescencyjny stos Z próbki.
   UWAGA: Stos z powinien całkowicie pokrywać próbkę z odstępem z mniejszym niż głębia ostrości. Dla obiektywu 1,45 NA 100x i komórek E. coli o grubości ~1 μm, 40 kroków przy 100 nm na każdy krok sprawdza się dobrze. W przypadku większych komórek lub komórek, które nie leżą idealnie płasko na powierzchni, może być potrzebne wykonanie 50 lub więcej kroków. Należy uwzględnić wystarczającą liczbę kroków i upewnić się, że próbka jest całkowicie rozmyta powyżej i poniżej.
   1. Do sterowania mikroskopem używaj oprogramowania powiązanego z mikroskopem (patrz Tabela materiałów).
   2. Skup się na środku komórki za pomocą koł ostrości mikroskopu. W trybie ND zaznacz pole Z, aby wziąć stos z. Kliknij przycisk Home, aby ustawić środek komórki jako punkt startowy. Ustaw rozmiar kroku na 0,1 μm, a zakres na 4 μm. Upewnij się, że urządzenie Z jest ustawione na poziom piezo.
   3. Ustaw kanały fluorescencyjne pod oknem Lambda na ustawienia dla obrazowanych cząsteczek fluorescencji. W tym eksperymencie użyto GFP i mCherry.
      UWAGA: Weź dodatkowy stos z tym samym rozmiarem kroku i zakresem w drugim kanale kolorowym, jeśli pożądany jest rozkład 3D dodatkowego kanału fluorescencyjnego. W tym eksperymencie użyto cytoplazmatycznego mCherry do określenia kształtu komórki, a MreB-GFP jako drugi kanał kolorowy.
   4. Upewnij się, że kolejność eksperymentu jest ustawiona na lambda (seria z), aby przed przełączeniem przyjął pełny stos z-stack w każdym kanale kolorów.
   5. Kliknij Uruchom teraz, aby rozpocząć akwizycję obrazu i zapisać plik, gdy jeden lub oba stosy z będą gotowe.
   6. Przejdź do nowego obszaru na padzie i powtórz kroki 1.2.2-1.2.5.

2. Rekonstrukcja komórek

1. Przytnij pojedyncze komórki i zapisz obrazy jako plik tiff stack, tak aby w każdym pliku była tylko jedna komórka. Upewnij się, że ta komórka jest dobrze odizolowana od innych komórek (czyli około 5x pełnej szerokości pół maksymalnej funkcji rozmycia w xy).
   UWAGA: Można to zrobić za pomocą darmowego oprogramowania do analizy obrazów (patrz Tabela materiałów).
   1. Narysuj ramkę wokół pojedynczej komórki i zduplikuj ją 2 razy, po raz dla każdego kanału. Upewnij się, że pole duplikatu hiperstacku jest zaznaczone i zmień kanał na 1 lub 2, upewniając się, że fragmenty zawierają cały stos z.
      UWAGA: Jeśli obrazujemy tylko kształt komórek, a nie dodatkowe białko fluorescencyjne, obecny będzie tylko jeden kanał.
   2. Gdy oba stosy będą dostępne, przejdź do Obrazów | Stosy | Narzędzia | Łącz obrazy, najpierw z kanałem białkowym, a potem z kanałem kształtu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Patyk watowy	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Używany do aplikowania VaLaP
Folia pokrywcza	VWR	16004-302
Fidżi	ImageJ	https://fiji.sc	Wykorzystywane do komórek cro
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	Połącz z parafiną i wazeliną, aby uzyskać VaLaP
Podłoże wzrostu LB	BD Difco	DF0446173
M63 medium	Biologia USA	M1015
MATLAB	Mathworks		Potrzebne do uruchamiania skryptów splotowych do przodu
Szkiełka mikroskopowe	Fisher	12-550-133
Elementy NIS	Nkon
Parafina	Sigma-Aldrich	327212
Wazelina	Equate	49035-038-27
Piezo z stage	Nikon	77011589
Końcówki Pipet - s.200	USA Scientific	1111-0730
Wskazówki dotyczące pipetów – s. 10	USA Scientific	1111-3730