Wizualizacja rozkładu białek bakteryjnych w trzech wymiarach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Abstract

Źródło: Bratton, B. P. i in., Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych dla dokładnych reprezentacji komórkowych i precyzyjnej lokalizacji białek. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje metodę pozyskiwania i analizowania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych komórek bakteryjnych w celu badania organizacji białek na poziomie pojedynczych komórek.

Protocol

1. Obrazowanie

1. Włóż szczelny szkiełko do mikroskopu i pozwól mu stać przez 5 minut, aby wyrównać temperaturę z otoczeniem. Pokój mikroskopu może mieć inną temperaturę niż pomieszczenie do przygotowania próbek.
2. Weź fluorescencyjny stos Z próbki.
   UWAGA: Stos z powinien całkowicie pokrywać próbkę z odstępem z mniejszym niż głębia ostrości. Dla obiektywu 1,45 NA 100x i komórek E. coli o grubości ~1 μm, 40 kroków przy 100 nm na każdy krok sprawdza się dobrze. W przypadku większych komórek lub komórek, które nie leżą idealnie płasko na powierzchni, może być potrzebne wykonanie 50 lub więcej kroków. Należy uwzględnić wystarczającą ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Patyk watowy	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Używany do aplikowania VaLaP
Folia pokrywcza	VWR	16004-302
Fidżi	ImageJ	https://fiji.sc	Wykorzystywane do komórek cro
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	Połącz z parafiną i wazeliną, aby uzyskać VaLaP
Podłoże wzrostu LB	BD Difco	DF0446173
M63 medium	Biologia USA	M1015
MATLAB	Mathworks		Potrzebne do uruchamiania skryptów splotowych do przodu
Szkiełka mikroskopowe	Fisher	12-550-133
Elementy NIS	Nkon
Parafina	Sigma-Aldrich	327212
Wazelina	Equate	49035-038-27
Piezo z stage	Nikon	77011589
Końcówki Pipet - s.200	USA Scientific	1111-0730
Wskazówki dotyczące pipetów – s. 10	USA Scientific	1111-3730