Ilościowa analiza obciążenia bakteryjnego jelitowego u danio pręgowanego Vibrio cholerae

Streszczenie

Źródło: Nag, D. i inni. Ilościowe określenie kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłych danio dano. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film prezentuje protokół mającycy mierzenie obciążenia bakteryjnego jelitowego u dorosłych danio zakażonych antybiotykoopornym szczepem Vibrio cholerae. Po eutanazji i sekcji przewód jelitowy jest izolowany, ujednolicany szklanymi kulkami i przetwarzany w celu uwolnienia bakterii. Powstały homogenat jest nakładany na selektywne ośrodko, a niebieskobiałe kolonie wyrażające β-galaktozydazę są liczone, aby oszacować obciążenie bakteriami.

Protokół

1. Określenie poziomów kolonizacji jelit

UWAGA: Kolonizacja jelit jest najbardziej użytecznym wskaźnikiem w modelu danio pręgowanego, ponieważ może być użyta do porównania względnej przystosowania różnych szczepów V. cholerae lub skutków mutacji czy knockoutów genów.

1. Eutanazja

1. Gdy eksperyment osiągnie pożądany cel, pobrać próbkę wody zakażonej (zwykle wystarczy 15 mL), aby umożliwić wydalanie bakterii oraz pomiar biegunki (np. test muciny, zawartość białka i/lub przedawkowanie), jeśli jest to pożądane.

2. Wylać resztę wody przez sieć rybakrową (do zbierania ryb) do wybielacza, aby zabić V. cholerae w wodzie.

3. Włóż rybę do zlewki zawierającej wodę zakażoną oraz 336 μg/mL etylo-3-aminobenzoanowego metanonosianianu (tricainy) i inkubuj rybę w tym roztworze tricainy przez 20 minut w RT.
UWAGA: Kabaretki zostały wysterylizowane roztworem wybielacza 10%.

2. Sekcja

1. Przygotowanie ryb

1. Wyjmij rybę z roztworu tricainy jednorazową plastikową łyżką i umieść ją na powierzchni rozcinania.

2. Ustaw rybę tak, że brzuszna strona jest skierowana do góry i przypiąć ją przez dolną szczękę, z tępym końcem szpilki skierowanym od środka ciała. Umieść kolejny szpilkę tuż za odbytem, również pod kątem od ciała.

2. Odsłonięcie przewodu jelitowego

1. Wymaz brzuszną powierzchnię ryby chusteczką bez kłaczków zanurzoną w 70% etanolu.

2. Wysterylizować skalpel i nożyczki Vanna, maczając je w 70% etanolu i podpalając na palenie.

3. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż brzucha tuż pod skórą, penetrując łuski i używając skalpela. Uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko, ponieważ przewód pokarmowy znajduje się tuż pod skórą.

4. Używając nożyczek, ostrożnie przedłuż nacięcia wzdłuż ciała, nie tnąc głębiej niż na poziomie skóry i omijając odbyt.

5. Wykonaj dwa boczne cięcia nożyczkami w kierunku głowy ryby, aby umożliwić otwarcie nacięcia.

6. Przypiń skórę po obu stronach nacięć bocznych do powierzchni rozcinania, ustawiając szpilki na zewnątrz, z dala od ciała.

UWAGA: Końcówki szpilek były wcześniej sterylizowane przez podpalenie alkoholem.

3. Usunięcie przewodu jelitowego

UWAGA: Przewód jelitowy powinien być widoczny jako jasna, bardzo cienka rurka na innych organach.

1. Sterylizacja kleszczy ogniowo, a następnie usunięcie przez nią całego przewodu jelitowego (zazwyczaj 12–15 mm długości). Umieść jelito w rurce homogenizacyjnej zawierającej szklane kulki (patrz kroki 1.3.1–1.3.2) oraz 1 mL 1x PBS lub LB, na lodzie.

3. Homogenizacja

1. Przygotuj rurki homogenizacyjne wcześniej, wlewając ~1,5 g szklanych kulek o średnicy 1 mm do rurek z nakrętką śrubkową o pojemności 2 mL (napełnij je mniej więcej do połowy), a następnie sterylizuj je przez autoklaw.

2. Dodaj 1 mL sterylnego LB lub 1x PBS.

3. Po dodaniu jelit danio danio (krok 1.2.3.1) do rurek, mocno przykręć nakrętki, a następnie zabezpiecz je w homogenizatorze wirowym.

4. Ujednolicić próbki na 1 minutę na maksymalnym ustawieniu, a następnie schłodzić je na lodzie przez 1–2 minuty. Powtórz ten cykl homogenizacji jeszcze raz, aby uzyskać pełną homogenizację. Uwaga: Kilka alternatywnych metod homogenizacji również się sprawdzi.

4. Ilościowe określenie poziomu kolonizacji jelit

1. Przygotuj probówki (małe szklane probówki lub mikrowirówki 1,5 mL) do seryjnego rozcieńczania homogenatu poprzez dodanie 900 μL LB lub 1x PBS do każdej probówki. Dla każdej ryby przygotuj 5–6 probówek i wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia homogenitu jelitowego, dodając 100 μL homogenitu do pierwszej probówki, wirując do mieszania, a następnie dodając 100 μL z pierwszej do drugiej probówki.

2. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną przygotowane.

3. Płytka 100–200 μL każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB zawierająca 100 μg/mL streptomycyny (jeśli stosuje się szczepy oporne na streptomycynę) oraz 40 μg/mL X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd). Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 16–18 godzin.

4. Po inkubacji nocnej licz kolonie V. cholerae na płytkach, używając automatycznego licznika lub ręcznie licząc kolonie; Pomocne jest zaznaczenie policzonych kolonii końcówką do markera.

5. Określ CFU na jelito ryby, mnożąc liczbę płytek przez współczynnik rozcieńczenia zawiesiny, uwzględniając objętość pokrycia powłoką.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instrument
Inkubator wstrząsający	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Inkubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spektrofotometr	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Homogenizator wirów	Minibeadbeater24	112011
Waga	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Mieszadło termiczne	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
Automatyczny licznik kolonii	REVSCI	120417B
Materiały
Szklane kubki 400 ml	Pyrex
Pokrywy perforowane	Uchwyt na mikrotipy z otworami od box na końcówki
Jednorazowe plastikowe łyżki	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
System akwarium	Aquaneering, San Diego, CA
RO Oczyszczacz Wody	Aqua FX	TK001
Sieć rybacka	Marina
Pokarm dla ryb	Płetwa tetra
Krewetki solankowe	Czerwony znak dżungli	O.S.I. PRO 80
Płyta styropianowa
Piny
Skalpele	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Kleszcze	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Nożyczki Vannas	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
Rurki z nakrętką 2 ml	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
Koraliki szklane o średnicy 1 mm	Bio Spec	11079110
Szklane koraliki do rozprzestrzeniania	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Płytka Petriego	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
Rurka do wirówki o pojemności 1,5 ml	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Rurka do wirówki 50 ml	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Probówki	Pyrex	9820
Szklana pipeta	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Mikropipety	Sartorius Biohit, Getynga, Niemcy	M1000/M200/M20
Porady	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemikalia
Sole oceaniczne Instant
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Trikaina (sól metanonsulfonianowa etylowo-3-aminobenzoanu	Sigma, St. Louis, MO	A5040
LB medium
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Oprogramowanie
Microsoft Office
Prism 5