Kolonizacja jelit i indukowanie biegunki przez Vibrio cholerae u dorosłych danio

Streszczenie

Źródło: Nag, D., et.al. Ilościowe określenie kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłych danio dano. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje szczepienie dorosłych danio patogennym szczepem Vibrio cholerae w celu badania kolonizacji jelit i wyników chorób. Pokazuje, jak toksyny bakteryjne zaburzają integralność jelit, prowadząc do wycieku płynu, wydzieliny śluzowej i wodnistej biegunki przed przygotowaniem ryb do dalszej analizy.

Protokół

1. Inokulacja danio pręgowanego przez zanurzenie
   UWAGA: Ten sposób narażenia przypomina naturalny przebieg infekcji.
   1. Przygotowanie Vibrio cholerae
      1. Zaszczepić 5 ml bulionu lizogenicznego (LB) izolowaną kolonią V. cholerae z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C z potrząskiem (180 obr./min) przez 6–8 godzin (nocna hodowla).
      2. Zaszczepić 25 mL świeżo autoklawowanego medium LB w stożkowej kolbie o pojemności 250 mL z 50 μL powyższej nocnej hodowli. Inkubuj go przez 16–18 godzin w temperaturze 37 °C z potrząskiem (150 obr./min).
      3. Odczytaj gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) rozcieńczenia hodowli nocnej, aby oszacować liczbę bakterii na mL (OD₆₀₀ = 1 to ~10⁹ CFU/mL).
      4. Komórki pobieraj przez wirowanie w 6 000 g przez 10 minut. Usuń medium pipetą lub wlej je do roztworu dezynfekcyjnego. Ponownie zawiesić komórki w bezpłodnym PBS do pożądanego stężenia, zazwyczaj od 1 x 10⁷ do 1 x 10¹⁰ na ml PBS.
         UWAGA: Tutaj nazywamy wodę z autoklawowaną osmozą odwróconą zawierającą 60 mg/L soli morskiej jako jałową wodę zakażenia.
   2. Inokulacja i inkubacja
      1. Włóż cztery lub pięć danio pręgowanych do zlewki 400 mL zawierającej 200 ml sterylnej wody zakażenia.
      2. Dodaj 1 mL V. cholerae , aby uzyskać pożądane stężenie infekcji (zazwyczaj 5 x 10^do 5 x 10^{7 CFU} /mL) w 200 mL wody infekcyjnej.
      3. Przykryj zlewkę perforowaną pokrywką, aby ryba nie wyskoczyła; górna część kolektora 200 μL dobrze się do tego nadaje.
      4. Oznacz każdą zlewkę i umieść ją w szklanym inkubatorze ustawionym na 28 °C na czas trwania eksperymentu.
   3. Procedura ekspozycji przejściowej
      UWAGA: Przejściowa ekspozycja na V. cholerae (zazwyczaj 6 godzin), po której następuje usunięcie bakterii inokulującej, jest przydatna do badania transmisji i dokładniejszego ilościowego określenia wydalanych bakterii.
      1. Po 6 godzinach ekspozycji wylej wodę z kubka przez sieć rybacką, aby zebrać ryby. Wyrzuć zainfekowaną wodę do pojemnika z wybielaczem, aby zabić V. cholerae.
      2. Umieść usuniętą rybę w zlewce z 200 mL sterylnej wody z infekcjami. Pozwól rybie pływać w tej czystej wodzie przez 5 minut, aby usunąć bakterie powierzchniowe z ryby.
      3. Powtórz procedurę z siecią i umieść rybę w nowej zlewce z 200 mL sterylnej wody infekcyjnej. Trzymaj ryby w tej zlewce przez cały czas eksperymentu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instrument
Inkubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Materiały
Szklane kubki 400 ml	Pyrex
Pokrywy perforowane	Uchwyt na mikrotipy z otworami od box na końcówki
System akwarium	Aquaneering, San Diego, CA
RO Oczyszczacz Wody	Aqua FX	TK001
Sieć rybacka	Marina
Pokarm dla ryb	Płetwa tetra
Płytka Petriego	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
Rurka do wirówki o pojemności 1,5 ml	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Probówki	Pyrex	9820
Mikropipety	Sartorius Biohit, Getynga, Niemcy	M1000/M200/M20
Porady	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Ekstrakt drożdżowy	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010