$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie płytek pożywki wzrostu nicieni (NGM) do badania wpływu różnych bakterii na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans (C. elegans)
- W szklanej butelce o pojemności 500 ml umieść 1,25 g peptonu, 1,5 g NaCl, 8,5 g agaru, mieszadło magnetyczne oraz 487,5 mL wody destylowanej.
- Dobrze wymieszaj mieszankę, autoklawuj przez 15 minut w temperaturze 121 °C, a następnie schłodzić do 55 °C w kąpieli wodnej przez 30 minut.
- Wyjmij podłoże z kąpieli wodnej, dodaj składniki (0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 mL cholesterolu, 0,5 mL MgSO4, 12,5 mL KPO4) do NGM i dobrze wymieszaj.
UWAGA: Wszystkie poszczególne składniki muszą być autoklawowane, z wyjątkiem cholesterolu (rozpuszczonego w etanolu bezwzględnym), a każdy etap eksperymentalny musi być wykonywany na czystym stole. - Rozprowadz 20 mL NGM do każdej miski Petriego o wymiarach 90 x 15 mm i pozwól agarowi zastygnąć na czystym stole w temperaturze pokojowej (około 20 °C). Płytki NGM można przechowywać do miesiąca w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. Przygotowano płytki NGM używane do barwienia FITC-dekstanem (fluoresceina izotiocyanian-dekstrana). 10 mL NGM zostało rozprowadzone do każdej miszki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm i pozostawiono do zastygnięcia na czystym stole w temperaturze pokojowej (około 20 °C). - Usuń hodowlę bakteryjną z lodówki o temperaturze 4 °C i dokładnie ją przeszukaj wirującym przed rozprowadzeniem hodowli na płytkach NGM.
- Dodaj łącznie 800 μL hodowli bakteryjnej na każdą świeżą płytkę NGM i pozwól płytkom wyschnąć w inkubatorze 20 °C przez noc.
UWAGA: Do pierwszego eksperymentu (Rysunek 1) przygotowano dwie płytki NGM z E. coli OP50, jedną płytkę NGM z P. aeruginosa PAO1 oraz jedną płytkę NGM z E. faecalis KCTC3206. Do drugiego eksperymentu (Rysunek 2) przygotowano dwie płytki NGM z żywym E. coli OP50, jedną płytkę NGM z żywym P. aeruginosa PAO1 oraz jedną płytkę NGM z inaktywowanym ciepło P. aeruginosa PAO1.
3. Przygotowanie zsynchronizowanych wiekowo C. elegans
- Hoduj robaki na solidnej płycie NGM i karm je E. coli OP50, aż osiągniesz pożądaną populację.
- Zsynchronizuj jaja za pomocą metody znoszenia jaj na czas lub roztworu wybielającego
4. Leczenie bakterii i żywienie FITC-dekstranem
- Inkubuj jaja zsynchronizowane z wiekiem w temperaturze 20 °C przez 64 godziny na płytkach NGM, uzupełnianych żywym E. coli OP50 jako pożywieniem.
- Przemyj zsynchronizowane z wiekiem larwy L4 buforem S i przenieś je (ponad około 500 robaków) na płytki NGM zawierające różne bakterie i chemikalia do obróbki. Inkubuj je w temperaturze 20 °C przez 48 godzin.
UWAGA: Czas leczenia może wynosić od 24 do 72 godzin, w zależności od użytych bakterii i chemikaliów. Efekt terapeutyczny lub zapobiegawczy DIM można również ocenić, wstępnie lecząc robaki patogenami, a następnie preparat DIM (efekt terapeutyczny) lub preparat DIM, a następnie patogeny (efekt zapobiegawczy). - Aby przygotować płytki uzupełnione z suplementacją FITC-dektranu, wymieszaj 2 mL inaktywowanego termicznie E. coli OP50 z 4 mg FITC-dekstranu. Następnie podziel 100 μL mieszaniny FITC-dektranu i E. coli OP50 na dwadzieścia świeżych płytek agarowych NGM (60 mm x 15 mm) i pozwól płytkom wyschnąć przez godzinę na czystym stole.
UWAGA: Końcowe stężenie FITC-dekstranu w każdej płycie NGM wyniesie 20 μg/mL. - Przygotuj pięć płytek NGM zawierających E. coli OP50 bez FITC-dekstranu do leczenia kontrolnego pojazdu. W tym celu podziel 100 μL E. coli OP50 inaktywowanego termicznie na każdej świeżej płytki agarowej NGM (60 mm x 15 mm) i pozwól płytkom wyschnąć przez 1 godzinę na czystym stole.
UWAGA: Dla każdego niezależnego eksperymentu wymaganych jest piętnaście płytek NGM uzupełnionych przez FITC-dektrany oraz pięć płytek NGM bez FITC-dekstranu. - Po 48 godzinach leczenia (od kroku 7.2) przemyj robaki buforem S, przenieś je na płytki uzupełnione FITC-dekstranem oraz płytki NGM bez FITC-dektranu i inkubuj płytki przez noc (14–15 godzin).
UWAGA: Dla każdej grupy leczenia wymagane jest 5 powtórzeń barwienia FITC-dekstran (lub podawania kontrolnego pojazdu). - Przemyj robaki buforem S i pozwól im wpełzać na świeżą płytkę agarową NGM przez 1 godzinę.
UWAGA: Na każdy niezależny eksperyment potrzebne jest łącznie 20 świeżych płytek NGM. W tym etapie możesz użyć płytki NGM uzupełnionej z E. coli OP50 lub bez niej. - Dodaj 50 μL roztworu 4% formaldehydu do każdej dołki czarnej płytki o płaskim dnie z 96 dołkami. Przenieś około 50 robaków z każdej płytki NGM do każdej jamki do pomiarów fluorescencji. Po 1 do 2 minutach dokładnie usuń cały formaldehyd z każdego dołka i dodaj 100 μL medium mocujnego, aby pokryć dołki.
UWAGA: Do unieruchamiania i utrwalania robaków stosuje się roztwór formacji formaldehydu (4%). Dla każdej grupy leczeń do analizy obrazowej stosuje się 5 dołków (5 replik).
5. Obrazowanie C. elegans za pomocą systemu obrazowania operetek oraz określenie przepuszczalności jelit poprzez pomiar wychwytu fluorescencji przez FITC-dekstern
UWAGA: Do analizy obrazów można stosować fluorescencyjną stereomikroskopię zamiast systemu Operetta.
- Rejestruj obrazy fluorescencyjne i mierz intensywność fluorescencji za pomocą systemu obrazowania Operetta High-Content oraz analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Harmony.
- W oprogramowaniu Harmony naciśnij ikonę Otwórz pokrywę , aby otworzyć pokrywę i włożyć płytkę do maszyny.
- Ustaw parametry.
- Kliknij Ustawij, wybierz typ płyty (96-dołkowy Corning flat-bottom) i dodaj kanały (kanały jasnego pola i EGFP).
- Dostosuj układ. Przejdź do wyboru Układ, a następnie wybierz Track i dostosuj parametry (pierwsze zdjęcie przy 1 μm, liczba płaszczyzn to 10, odległość to 1 μm).
- Wybierz jedną z studni oczyszczających i jedno pole przechwytujące, a naciśnij Test, aby sprawdzić, czy zdjęcia są satysfakcjonujące w sekcji Run eksperyment .
- Jeśli zdjęcia są zadowalające, wróć do sekcji Konfiguracja i naciśnij ikonę Reset na końcu ekranu. Następnie wybierz wszystkie docelowe studnie i odpowiednią liczbę pól przechwytu.
- Przejdź ponownie do Uruchom eksperyment i wpisz nazwę tablicy, a następnie naciśnij Start , aby rozpocząć przetwarzanie.
- Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, przejdź do sekcji analizy obrazu i wprowadź obraz. Znajdź komórkę, wybierając kanał EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) i metodę B. Dostosuj wspólny próg do 0,5, pole do >200 μm2, współczynnik podziału do 3,0, indywidualny próg do 0,18 oraz kontrast do ponad 0,18. Następnie obliczamy właściwości intensywności i wybieramy średnią jako wyjście. Naciśnij ikonę Apply , aby zapisać konfigurację.
- Przejdź do sekcji Ewaluacja , aby zmierzyć intensywność, pobierając mapę ciepła i tabelę danych. Ustaw parametr odczytu na komórki — Intensywność, Średnia EGFP komórki — Średnia na studnię i rozpocznij ocenę.
UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. - Aby wyodrębnić dane z Operetta, kliknij przycisk Ustawienia i wybierz zarządzanie danymi.
- Wybierz Write archive, a następnie otwórz przeglądanie i wybierz plik.
- Aby zaznaczyć plik, kliknij mały sygnał + w lewym rogu, a następnie kliknij Pomiar i wybierz nazwę tablicy.
- Wybierz plik i kliknij OK.
- Wybierz ścieżkę, aby zapisać plik, klikając sygnał Przeglądaj na aktywnej ścieżce.
- Kliknij Start, aby zapisać plik danych.
UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj.
