Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie kultur Salmonella Typhimurium ΔAroA do doustnej dawki myszy
- Z zamrożonego zapasu glicerolu S. Typhimurium ΔAroA przygotuj płytkę smugową z agarem Luria-Bertani (agar LB) zawierającą 100 μg/mL streptomycyny z sterylną pętlą inokulacyjną. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Płyty smug można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4 °C.
- Dzień przed zakażeniem przygotuj antybiotyk, rozpuszczając 0,5 g streptomycyny w 2,5 ml wody. Po sterylizacji roztworu streptomycyny przez filtr, doustnie podaj myszy igłą gavage o pojemności 22 g z bulbowym końcem oraz strzykawką 100 μL roztworu streptomycyny (20 mg streptomycyny/dawkę). Za pomocą pętli inokulacyjnej inokuluj 3 mL bulionu LB (50 μg/mL streptomycyny) w probówce hodowlowej z jedną kolonią. Inkubuj hodowlę salmonelli aerobnie w temperaturze 37 °C przez noc, z potrząsaniem z prędkością 200 obrotów na minutę (RPM).
- W dniu zakażenia przygotuj ostateczną dawkę infekcji, wykonując 2 kolejne 1/10 rozcieńczeń nocnych posiew Salmonelli w sterylnej soli fosforanowej (PBS). Skutkowałoby to inokulum o pojemności 100 μL zawierającym około 3 x 106 jednostek formujących kolonie (CFU).
- Używając igły gavage o pojemności 22 g z końcówką z żołdką i strzykawki 1 mL, podaj każdej myszy 100 μL przygotowanej Salmonelli.
UWAGA: Przygotuj hodowle salmonelli z użyciem technik aseptycznych. Ostateczne stężenie szczepionkowe Salmonelli można zweryfikować poprzez seryjne rozcieńczenia na agarze LB streptomycyną.
2. Ocena obciążenia salmonellą w tkankach
- Przygotuj mikrorurki o pojemności 2 mL z zamkiem bezpiecznym i okrągłym dnem, z 1 mL sterylnego PBS i autoklawowaną kulką ze stali nierdzewnej. Przed pobraniem tkanek zważ rurki.
- Usuń tkanki cekalne i śledzionowe od myszy uśpionych przez ekspozycję na dwutlenek węgla. Zbieraj tkanki od poszczególnych zwierząt w osobnych probówkach. Zważ rurki, aby określić wagę tkanek.
- Homogenizuj za pomocą urządzenia mieszalnika przez 15 minut przy częstotliwości 30 Hz. Przelej 900 μL PBS na odwiert w 96-dołowym bloku 2 mL mega. Pipeta 100 μL tkanki ujednolici w pierwszej dołku, dobrze wymieszaj i wykonuj kolejne rozcieńczenia, dodając 100 μL do kolejnych dołków, aż uzyskamy rozcieńczenie 10⁻⁶. Płytka 10 μL każdego rozcieńczenia w potrójnym wykładzie na agar LB zawierający 100 μg/mL streptomycyny.
- Policz i pomnóż średnią CFU przez czynnik 100, ponieważ 10 μL z próbki 1000 μL zostało pokryci, oraz odpowiedni współczynnik rozcieńczania. Podziel masę tkanek CFU przez masy tkanek, aby określić CFU na gram tkanki.
UWAGA: Wszystkie próbki przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C podczas przetwarzania tkanek. Stosuj końcówki pipet o szerokim otworze podczas wykonywania seryjnego rozcieńczania z użyciem homogenatów tkanek. Przygotuj megablok z 96 studniami zawierający PBS z wyprzedzeniem.
