Przygotowanie Gardnerella wagalis inoculum do modelowania nawracających infekcji dróg moczowych u myszy

Streszczenie

Źródło: O'Brien, wiceprezes i inni. Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana przez narażenie pęcherza pochwy Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film prezentuje przygotowanie szczepionki Gardnerella wagalis w celu ustanowienia mysiego modelu nawracającej infekcji dróg moczowych.

Protokół

1. Przygotuj Gardnerella wagalis inoculum
   UWAGA: Wszystkie etapy wykonuje się w komorze beztlenowej. Idealne czasy inkubacji hodowli różnią się w zależności od rodzaju szczepu G. vaginalis, przy czym niektóre wchodzą w fazę stacjonarną, a nawet zaczynają szybciej obumierać niż inne. Dlatego czasy inkubacji powinny być empirycznie określane dla danego szczepu przed przeprowadzeniem eksperymentów na myszach. Nie wiadomo, czy pozostałe/wszystkie szczepy G. vaginalis wywołają takie same efekty w tym modelu.
2. Szczep Streak G. wagalis z wywaru zamrażanego o temperaturze -80 °C na płytkę NYCIII (bez antybiotyków). Inkubuj płytkę w 37 °C beztlenowo przez 24 godziny.
3. W komorze beztlenowej inokuluj 5 mL beztlenowego podłoża NYCIII z pętlą komórek o pojemności 1 μL (pojedyncza kolonia jest niewystarczająca) z płytki NYCIII i inkubuj hodowlę statyczną w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych przez 18 godzin. Nie włączaj antybiotyków do podłoża wzrostowego.
4. Określ OD⁶⁰⁰ hodowli za pomocą spektrofotometru
   1. Wiruj określoną objętość (X) hodowli w 9600 × g przez 1 minutę i aspiruj podłoże. Oblicz objętość (Y) soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby ponownie zawiesić pellet i osiągnąć pożądaną gęstość optyczną inokulum (OD), aby uzyskać 10⁸ jednostek kolonii (CFU) w 50 μL, stosując następujące równanie: X mL × ODculture = Y mL × ^{OD inokulum} , rozwiąż YY = (X ml × ODculture) / OD ^inokulum
      UWAGA: ^Inokulum przedawkowania dla^{JCP8151B SmR} wynosi 5, ale dla innych szczepów G. vaginalis musi to być określone empirycznie. Na przykład, jeśli odkręcanie 3 mL płynnej kultury JCP8151B^SmR przez noc z ODculture = 2,0: Y = (3 mL × 2,0) / 5,0; dlatego ponownie zawiesz granulki w 1,2 mL PBS.
   2. Ponownie zawiesij granulat bakteryjny w PBS do pożądanego stężenia. Stopniowo rozcieńczaj i nakładaj inokulum, aby określić rzeczywistą dawkę inokulum stosowaną w każdym eksperymencie. Nie polegaj wyłącznie na wartościach OD.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glukoza	Sigma	G7528	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowy kwas (HEPES)	Cellgro	25-060-Cl	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Chlorek sodu	Sigma	S3014	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Proteose peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Ekstrakt drożdżowy	Fisher	DF0127-17-9	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Spektrofotometr	BioChrom	80-3000-45	Pomiar bakteryjnego OD600
Streptomycyna	Gibco	11860038	Dodaj do G. vaginalis NYCIII selektywne płytki (1 mg/mL)