Przetwarzanie zakażonych tkanek do enumeracji bakterii w modelu współinfekcji myszy

Streszczenie

Źródło: Lenhard, A. i inni. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje przetwarzanie płuc przez mysz współzakażoną patogenną bakterią i wirusem. Rozdrobnienie, homogenizacja i poszycie tkanki płucnej pozwala na ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego, co wskazuje na rozprzestrzenianie się bakterii do płuc i nasilenie choroby.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przetwarzanie zakażonych tkanek w celu wyliczania bakterii

1. Zbieranie płuc
   1. Używając nożyczek do sekcji, przeciń boki odsłoniętej klatki piersiowej i delikatnie pociągnij żebra w stronę głowy myszy, aby odsłonić serce. Do prawej komory należy włożyć igłę 25 g podłączoną do strzykawki 10 mL z prefabrykowaną solą fizjologiczną (PBS) i rozpocząć powolne przetłuszczanie. Zwracaj uwagę na wybielanie płuc jako wskaźnik skutecznej perfuzji. Płucz powoli, aby nie przełamać tkanki płucnej.
   2. Podnieś serce kleszczemi i zrób cięcie, aby oddzielić płuca od serca. Po rozdzieleniu podnieś wszystkie płaty płuc kleszcze i przepłucz w misce sterylnym PBS, aby usunąć resztki krwi. W szalce Petriego pokłąb płuca na małe kawałki i dobrze wymieszaj. Usuń połowę mieszanki płucnej w celu określenia jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU) lub jednostek wirusowych tworzących płytki nazębne (PFU) i umieść ją w probówce o pojemności 15 ml z okrągłym dnem napełnioną 0,5 mL PBS w celu homogenizacji.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie pobierać różnych płatów tego samego płuca podczas różnych badań. Zamiast tego wszystkie płatki powinny być podrobnione, dobrze wymieszane i równomiernie rozdzielone do różnych ocen.
2. Aby ujednolicić zebraną tkankę, najpierw wyczyść sondę homogenizatora, wlewając ją do 70% etanolu i włączając homogenizator na 60% mocy przez 30 sekund. Powtórz ten krok w wodzie sterylnej przez 10 sekund. Ujednolicaj każdą tkankę przez 1 minutę. Czyść sondę homogenizatora w wodzie sterylnej między każdą próbką oraz w świeżej tubce zawierającej 70% etanolu między każdym organem a grupą próbek.
3. Enumeracja liczb bakterii
   1. Po pobraniu i ujednoliceniu wszystkich organów należy stosować seryjne rozcieńczenia płytek na płytach agaru krwi. Aby obliczyć całkowity CFU, użyj 10 μL do płytowania i zapisz końcową objętość w mL dla każdej próbki. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C/5%_CO2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jednorazowe strzykawki BD z końcówkami Luer-Lok (1 mL)	Fisher	14-823-30
Delikatne nożyczki do rozcinania Fisherbrand	Fisher	08-951-5	Narzędzia używane do zbiorów
Kleszcze do rozcinania tkanek Fisherbrand	Fisher	13-812-38	Kleszcze do zbioru
Sterylne strzykawki Fisherbrand do jednorazowego użytku (10 mL)	Fisher	14-955-459