Generowanie monowarstwy ludzkiej kolonoidu z funkcją bariery do badania interakcji gospodarz–patogen

Abstract

Źródło: In, J. G. i in. Monowarstwy ludzkich koloniów do badania interakcji między patogenami, komensalami a nabłonkiem jelitowym gospodarza. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje procedurę hodowania komórek nabłonkowych pochodzących z jelita grubego na systemie Transwell pokrytym kolagenem, aby uzyskać monowarstwę produkującą śluz, która modeluje barierę jelitową i umożliwia badania interakcji gospodarz–patogen.

Protocol

1. Powlekanie zawiesziny enteroidalnej/kolonoidowej

1. Jeśli wkładki powlekane były przechowywane w temperaturze 4 °C, należy wyrównać w inkubatorze do hodowli tkanek o temperaturze 37 °C/5%_CO2 na co najmniej 30 minut przed nałożeniem komórek.
2. Do każdej wkładki do powlekania przygotuj 1 ml ciepłego (między 25-37 °C) medium rozszerzającego (EM) i dodaj 10 μM Y-27632 oraz 10 μM CHIR 99021.
   UWAGA: EM składa się z zaawansowanego DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) / F12 zawierającego B27 (1x), 50% WNT3A podłoża kondicjonowanego, 15% RSPO1 podłoża kondicjonowanego, 10% podłoża kondicjonowanego Noggin, 50 ng/mL ludzkiego EGF (Epidermal Growth Factor), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, koktajlu antybiotykowo-antymykotycznego (1x), 10 mM HEPES (N-(2-hydroksetyetylo)piperazyna-N'-(2-kwas etansulfonowy)), Dizoptyd L-alanyl-L-glutaminy (1x) oraz penicylina-streptomycyna (1x) (patrz Tabela materiałów).
3. Aspiruj medium płuczkowe z rurki zawierającej pellet komórki i ponownie zawiesij w objętości EM wystarczającej do uzyskania co najmniej 100 μL/wkładka.
4. Z każdej wkładki oddechuj roztwór kolagenu IV i myj dwukrotnie, używając 150 μL medium do mycia na wkładkę.
5. Pipeta 600 μL EM do przestrzeni pod każdą wkładką.
6. Pipeta włóż 100 μL zawiesiny ogniwowej do każdej wkładki.
7. Zwróć płytkę do inkubatora do hodowli tkanek i zostawij ją niezakłóconą przez co najmniej 12 godzin.
   UWAGA: Unikaj potrząsania lub gwałtownego przechylania płytki, aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu fragmentów kolonoidu na błonie wkładki.
8. Monitoruj przyczepianie i rozprzestrzenianie się komórek, aby utworzyć konfluentną monowarstwę, umieszczając płytkę na mikroskopie z kontrastem fazowym pod obiektywem 2,5x-10x.
9. Po 1-2 dniach większość fragmentów powinna przykleić się do matrycy kolagenowej. Odśwież pożywkę hodowlową i zakończ leczenie Y-27632 oraz CHIR 99021. Kontynuuj odświeżanie podłoża co 2-3 dni, aż do połączenia się. Zbieg się zwykle osiąga w ciągu 7-10 dni.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(hydroksymitylo)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Baza tris, składnik buforu lizy
A-83-01	Tocris	2939	Inhibitor ALK4/5/7
Kwas octowy, lodowiec	Fisher Scientific	A38
Zaawansowane DMEM/F12	Technologie życia	12634-010	Składnik podłoża wzrostu
Koktajl antybiotyk/antymykotyczny	Invivogen	ANT-PM-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Technologie życia	17504-044	Składnik podłoża wzrostu
Wkładki do hodowli komórkowych	Corning	3470	Przepustnik, membrana PET, por 0,4 μm, płytka 24-dołkowa
CHIR 99021	Tocris	4423	Inhibitor GSK3β
Kolagen IV, pochodzący z ludzkiego łożyska	Sigma	C5533
Roztwór do pozyskiwania organoidów Cultrex	Trevigen	3700-100-01	Depolimeryzuje matrycę błony podstawnej
Etanol, absolutnie	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Technologie życia	35050-061	Dipeptyd L-alanyl-L-glutaminy, 200 mM
Linia komórkowa HEK293T/Noggin-Fc	Laboratorium van den Brink, Instytut Badań nad Wątrobą i Jelitami im. Tytgat		Do produkcji podłoża kondycjonowanego Noggin
Linia komórkowa HEK293T/RSPO1-Fc-HA	Trevigen	3710-001-K	Do produkcji podłoża kondycjonowanego Rspondin-1
HEPES, 1 M	Technologie życia	15630-080	Składnik podłoża wzrostu
Ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGF)	Systemy R&D	236-EG-01M	Składnik podłoża wzrostu
Mikroskop świetlny z odwróconą hodowlą komórek	Olympus	CKX51
Linia komórkowa L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	Do produkcji kondycjonowanego medium Wnt3a
Matrigel, współczynnik wzrostu obniżony	Corning	356231	Macierz błony podstawowej dla hodowli 3D
Mini skrobak komórek	United BioSystems	MCS-200
Przeciwciało MUC2, monoklonalne na myszy	Abcam	ab11197	Stosuj w 1:100 do immunobarwienia, 1:500 do immunoblottingu
Cząstki lentiwirusowe MUC2 shRNA	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ lentiwirusowy shRNA, ID: 4583
Orbitalny potrząsacz	Instrumenty grantowe	PSU-10i
Penicylina-streptomycyna, 100x	Technologie życia	15140-122	Składnik podłoża wzrostu
Sonikator sondy z mikrokońcówką	Branson Ultrasonics	450
Koktajl inhibitorów proteaz dla komórek ssaków	Sigma	P8340	Składnik buforu lizy
SB 202190	Tocris	1264	Inhibitor p38 MAPK
Chlorek sodu	Sigma	S3014	Składnik buforu lizy
Deksoycholan sodu	Sigma	D6750	Składnik buforu lizy
Siarczan sodu dodecylowy	Sigma	L3771	Składnik buforu lizy
TrypLE Express, 1x	Technologie życia	12605-010	Trypsyna do trawienia fragmentów jelitowo/kolonoidowych
Przeciwciało vinculin, króliczy monoklonal	Abcam	ab129002	Zastosowanie w 1:1000 do immunoblotingu
Woda, jakość do hodowli tkankowej, filtrowana sterylnie	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	Inhibitor RhoA/ROCK