Generowanie sferoplastów z bakterii Gram-ujemnych

Streszczenie

Źródło: Figueroa, D. i in. Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu charakteryzacji lokalizacji antybakteryjnych peptydów. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje przygotowanie sferoplastów z pręcikowatych, gram-ujemnych bakterii. Bakterie są hodowane w obecności antybiotyku, tworząc wydłużone włókna. Są one myte roztworem hipertonicznym i traktowane buforem lizowym, aby usunąć zewnętrzną ścianę komórkową. Leczenie hipotoniczne tworzy sferoplasty, które są stabilizowane schłodzonym roztworem izotonicznym i przechowywane w warunkach chłodnych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Przygotuj roztwory opisane w krokach 1.1–1.9, aby uzyskać sferoplasty Escherichia coli (E. coli)

1. Przygotuj 1 M tris(hydroksymitylo)aminometalowodorku (Tris-Cl), pH 7,8, rozpuszczając 10,34 g Tris·HCl i 4,17 g tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris·OH) w 50 mL wody destylowanej (dH₂O) w kolbie 125 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj roztwór A (20 mM chlorku magnezu (MgCl₂), 0,7 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) poprzez rozpuszczenie 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) i 11....

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy bakterii Escherichia coli. (A) bakterii E. coli , (B) węża E. coli oraz (C) sferoplastu E. coli . Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 100X.

....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydrokloridz tryzma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Baza Trizma (Tris OH)	Sigma	T1503
Chlorek magnezu	Sigma	M8266
Sacharoza	Sigma	S7903
Lizozym	Sigma	L6876
Deoksyrybonukleaza I	Sigma	D4527
Kwas etylendiaminetetraoctowy	Sigma	106361	Używałem Sigma 106361 przy tworzeniu oryginalnych protokołów; 106361 zakończony z ED2SS jako zastępcą
Hydrat cefaleksyny	Sigma	C4895
Bulion sojowy BBL Trypticase	Fisher Scientific	B11768
Kwas maleinowy	Sigma	M0375
Filtr strzykawkowy akrodyskowy 25 mm z membraną tuffryn HT 0,2 μm	Pall Corporation	4192