Generowanie sferoplastów z bakterii Gram-ujemnych

Streszczenie

Źródło: Figueroa, D. i in. Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu charakteryzacji lokalizacji antybakteryjnych peptydów. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje przygotowanie sferoplastów z pręcikowatych, gram-ujemnych bakterii. Bakterie są hodowane w obecności antybiotyku, tworząc wydłużone włókna. Są one myte roztworem hipertonicznym i traktowane buforem lizowym, aby usunąć zewnętrzną ścianę komórkową. Leczenie hipotoniczne tworzy sferoplasty, które są stabilizowane schłodzonym roztworem izotonicznym i przechowywane w warunkach chłodnych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Przygotuj roztwory opisane w krokach 1.1–1.9, aby uzyskać sferoplasty Escherichia coli (E. coli)

1. Przygotuj 1 M tris(hydroksymitylo)aminometalowodorku (Tris-Cl), pH 7,8, rozpuszczając 10,34 g Tris·HCl i 4,17 g tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris·OH) w 50 mL wody destylowanej (dH₂O) w kolbie 125 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj roztwór A (20 mM chlorku magnezu (MgCl₂), 0,7 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) poprzez rozpuszczenie 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) i 11,98 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 mL dH₂O w kolbie 125 mL. Dodaj 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i dostosuj objętość do 50 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj roztwór B (10 mM MgCl₂, 0,8 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) przez rozpuszczenie 0,05 g MgCl₂ (95,2 g/mol) i 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 mL dH₂O w kolbie 125 mL. Dodaj 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i dostosuj objętość do 50 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
4. Przygotuj 0,8 m sacharozy, rozpuszczając 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 50 mL dH₂O w kolbie 125 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
5. Przygotuj deoksyrybonukleazę I (DNaza I) o stężeniu 5 mg/mL poprzez rozpuszczenie 0,015 g DNazy I w 3 mL dH₂O w kolbie 50 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o średnicy 0,2 μm. Roztwór aliquot umieść w rurkach mikrofugowych i przechowuj w temperaturze −20 °C.
6. Przygotuj 0,125 M etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA), pH 8,0, rozpuszczając 0,698 g EDTA disodowego dwuchlorku (372,2 g/mol) w 15 mL dH₂O w kolbie 125 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
7. Przygotuj 600 μg/mL cefaleksyny, rozpuszczając 0,03 g hydratu cefaleksyny (365,404 g/mol) w 50 mL dH₂O w kolbie 125 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze 4 °C.
8. Przygotuj lizozym o stężeniu 5 mg/mL, rozpuszczając 0,015 g lizozymu w 3 mL dH₂O w kolbie 50 mL. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o średnicy 0,2 μm. Roztwór aliquot umieść w rurkach mikrofugowych i przechowuj w temperaturze −20 °C.
9. Przygotuj 3% bulionu sojowego z tryptazą (TSB), rozpuszczając 30 g TSB w 1 L dH₂O w kolbie 2 L. Roztwór zaniedłużać do kolb zawierających 25 mL lub 100 mL TSB, które mają być użyte odpowiednio do przygotowania sferoplastów E. coli lub protoplastów B. megatirium. Kolby autoklawu do sterylizacji płynnego medium. Sterylny TSB można przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
10. Przygotuj roztwór C (1 M sacharozy, 0,04 M maleianu, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) poprzez rozpuszczenie 34,23 g sacharozy (342,3 g/mol), 0,46 g kwasu maleinowego (116,07 g/mol) oraz 0,38 g MgCl₂ (95,21 g/mol) w 100 mL dH₂O w kolbie 250 mL. Zreguluj pH do 6,5. Sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z membraną o pojemności 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie kultury nocnej

UWAGA: Wykonaj sekcje 2-3 przy użyciu odpowiednich technik sterylnych. Jeśli szczep bakteryjny może zawierać plazmid o oporności na antybiotyki, aby zmniejszyć potencjalne zanieczyszczenie. Jeśli używasz szczepu o oporności na antybiotyki, dodaj niezbędne antybiotyki w krokach 2.1 oraz 3.1–3.2.

1. Przygotuj hodowlę nocną, wybierając pojedynczą kolonię bakterii za pomocą sterylnej końcówki pipety i umieszczając ją w probówce hodowli 14 mL zawierającej 2–3 mL 3% w/v TSB. Inkubuj w temperaturze 37 °C, potrząsając przez 16–21 godzin.

3. Przygotowanie Gram-ujemnych E. coli sferoplastów

1. W kolbce 250 mL rozcieńcz nocną hodowlę 1:100 w objętości 25 mL o objętości 3% w/v TSB i inkubuj roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez około 2,5 godziny, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,5–0,8 na 600 nm. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
2. W kolbce o pojemności 250 mL rozcieńcz tę hodowlę w stosunku 1:10 w 30 mL 3% w/v TSB i inkubuj w 37 °C, jednocześnie potrząsając przez 2,5 godziny w obecności cefaleksiny 60 μg/mL (347,4 g/mol), aby uzyskać włókna jednokomórkowe o długości około 50–150 μm, które można obserwować przy powiększeniu 1000X za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 1B).
3. Filamenty zbieraj, wirując roztwór bakteryjny w stężeniu 1 500 x g, 4 °C przez 4 minuty. Przelej i wyrzuć supernatant, zachowując granulki.
4. Delikatnie umyj filamenty, dodając 1 ml sacharozy 0,8 M, uważając, aby nie ruszyć granulatu. Inkubuj przez 1 minutę, a następnie wyrzuć supernatant bez naruszania granulki.
5. Do pelletu należy dodać 150 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL lizozymu 5 mg/mL, 30 μL DNazy I o stężeniu 5 mg/mL oraz 120 μL 0,125 M EDTA w odpowiedniej kolejności i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
6. Stopniowo dodawaj 1 ml roztworu A przez 1 minutę do roztworu przygotowanego w 3,5 milimetra za pomocą mikropipety, delikatnie mieszając roztwór ręcznie. Inkubuj roztwór przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Wlej 7 mL roztworu B o temperaturze 4 °C do dwóch stożkowych rurek po 15 mL. Dodaj równe ilości roztworu przygotowanego w 3,6 do każdej z tych dwóch probówek. Wiruj roztwór w 1 500 x g, 4 °C przez 4 minuty.
8. Używając pipety serologicznej, ostrożnie usuń wszystkie oprócz 1-2 mL supernatantu, nie naruszając granulatu. Ponownie zawiesij pellet, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P1000. Wizualnie sprawdź formowanie się sferoplastów, obserwując próbkę przy powiększeniu 1000 X za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 1C).
9. Przechowuj sferoplasty w temperaturze -20 °C przez tydzień lub do momentu, aż przejdą przez 3 cykle zamarzania i rozmrażania.

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy bakterii Escherichia coli. (A) bakterii E. coli , (B) węża E. coli oraz (C) sferoplastu E. coli . Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 100X.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydrokloridz tryzma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Baza Trizma (Tris OH)	Sigma	T1503
Chlorek magnezu	Sigma	M8266
Sacharoza	Sigma	S7903
Lizozym	Sigma	L6876
Deoksyrybonukleaza I	Sigma	D4527
Kwas etylendiaminetetraoctowy	Sigma	106361	Używałem Sigma 106361 przy tworzeniu oryginalnych protokołów; 106361 zakończony z ED2SS jako zastępcą
Hydrat cefaleksyny	Sigma	C4895
Bulion sojowy BBL Trypticase	Fisher Scientific	B11768
Kwas maleinowy	Sigma	M0375
Filtr strzykawkowy akrodyskowy 25 mm z membraną tuffryn HT 0,2 μm	Pall Corporation	4192