Ustanowienie mysiego modelu infekcji paciorkowcem grupy B pochwy

Streszczenie

Źródło: Patras, K. A., Doran, K. S. Model myszy kolonizacji pochwy grupy B Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje przygotowanie i zaszczepienie pochwy u samicy myszy leczonej hormonami paciorkowcem grupy B w celu modelowania infekcji. Wyjaśnia, jak hodować i przygotowywać bakterie, podawać inokulum do lumenu pochwy oraz zapewnić skuteczną infekcję.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Inokulacja pochwowa paciorkowcem grupy B (GBS)

1. Dzień przed szczepieniem hodować 5-ml nocną płynną hodowlę szczepu GBS, takiego jak A909 (serotyp Ia), w bulionie Todd Hewitt (THB) w temperaturze 37 °C.
2. Podhoduj GBS przez noc w objętości 1:10 do świeżego THB i inkubuj w 37 °C. Rozwijaj bakterie do fazy średniej logariatusu (OD₆₀₀ = 0,4-0,5).

UWAGA: Zazwyczaj trwa to 2-3 godziny, w zależności od szczepu GBS.

3. Przenieś podhodowlę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i bakterii granulujących w dawce 3 000 × g przez 5 minut. Aspiruj nadwysoka. Ponownie zawiesij granulkę bakteryjną w 200 μl bezpłodnej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
4. Używając ponownie zawiesowanego pelletu, doprowadź 3-5 ml PBS (1 ml na 10 myszy) do dokładnie przedawkowania₆₀₀ = 0,4 w nowej probówce hodowli 5 ml. Będzie to stężenie ~1 × 10⁸ jednostek kolonii (CFU)/ml. Przełóż do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ponownie rozpylaj bakterie w dawce 3 000 × g przez 5 minut. Aspiruj nadwysoka.
5. Zawiesić kulkę w PBS na 1/10 pierwotnej objętości. Na przykład, jeśli 3 ml OD₆₀₀ = 0,4 zostało zasypanych granulkami, można je ponownie zawiesić w 300 μl PBS.

UWAGA: Jest to ostatnia zawiesina bakteryjna (~ 1 ×^10,9 CFU/ml) stosowana do szczepienia zwierząt.

6. Zarezerwuj 50 μl tej zawiesiny do seryjnego rozcieńczania i powłoki na agarze THB, aby określić dokładne inokulum.
7. Zaszczep każdą mysz 10 μl końcowej zawiesiany bakteryjnej, aby każdej myszy podano 1 × 10^{7 CFU} .
   1. Aby zaszczepić, unieruchom mysz ręcznie, zabezpieczając luźną skórę na karku między kciukiem a palcem wskazującym opiekuna, a następnie unieruchomiając ogon.
   2. Nabierz 10 μl GBS do końcówki pipety ładowającej żelowe o pojemności 200 μl. Włóż końcówkę 5 do 10 mm do światła pochwy i wydaj 10 μl inokulum.
      UWAGA: Końcówki do ładowania żelowego są preferowane zamiast standardowych końcówek 200-μl, aby zminimalizować ryzyko urazu lub urazu narządów, szczególnie u młodszych lub mniejszych myszy.
   3. Bezpośrednio po szczepieniu puść kark i unieś tylną część myszy, podnosząc mysz za ogon i chodząc przednimi łapami po twardej powierzchni przez ~ 1 minutę.
   4. Sprawdź wizualnie otwór pochwy pod kątem cofania się inokulum. Jeśli zaobserwuje się cofnięcie, można użyć świeżej końcówki pipety do manipulacji lub powiększenia otwóru pochwy, ułatwiając wchłanianie przepływu do lumenu. Dodatkowo przepływ wsteczny może być zasysany przez pipetę i ponownie zaszczepiony.
      UWAGA: Jeśli podawa się środki miejscowe, organizmy probiotyczne lub interesujące białka, w traktie pochwowym można podać objętość do 20 μl w buforze fizjologicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Końcówki pipety ładowane żelowe 200 μl	USA Scientific	1252-0610
Bulion Todda Hewitta	Diagnostyka Hardy	7161C
Roztwór soli buforowanej fosforanem Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV