Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Streszczenie

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum. J. Vis. Exp. (2016)

Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy, podczas gdy studnie poddawane zabiegom wykazują zmniejszoną formację. Do barwienia biofilmu używa się barwnika kationowego, a mierzy się absorpcję w celu oceny biomasy.

Protokół

1. Ilość powstawania biofilmu w Crystal Violet u A. baumannii S1

1. Hodować hodowlę 5 ml Acinetobacter baumannii S1(A. baumannii) w bulionie Lysogeny (LB) (trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L) w 30 °C w inkubatorze potrząsającym (220 obr./min) przez 16 godzin.
2. Dostosuj hodowlę A. baumannii S1 do pożądanej gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) 0,8. Używając płytki z 96 dołkami, inokuluj hodowlę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do świeżej LB zawierającej 10 μl oczyszczonego enzymu GKL (40 mg/ml); Ostatni tom nowej kultury to 100 μl.
3. Przygotuj także kulturę kontroli; nie zawiera on żadnych enzymów. Powtarzaj podobne warunki, aby uzyskać pożądaną liczbę replikacji.
4. Przykryj talerz pokrywką i włóż do szczelnego plastikowego pojemnika o pojemności 10 L. Inkubuj płytkę w 30 °C przez 3 godziny, zanim delikatnie wyjmiesz podłoże.
5. Dodaj kolejne 100 μl świeżego medium LB do studni i inkubuj płytę przez 21 godzin w temperaturze 30 °C.
6. Po drugim okresie inkubacji delikatnie usuń wszystkie podłoża. Umyj komórkę bakterii planktonicznej wodą sterylną o stężeniu 200 μl. Upewnij się, że podczas mycia komórki są minimalnie zakłócone.
7. Dodaj 100 μl roztworu fioletu kryształowego o stężeniu 1% do każdego dołku i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór fioletowego kryształu przez przepłukanie studni wodą sterylną o stężeniu 200 μl. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
8. Dodaj 100 μl kwasu octowego 33% do każdego dołku i inkubuj przez 15 minut z delikatnym potrząsaniem; To rozpuści barwnik.
9. Ilościowo określ ilość powstałego biofilmu, mierząc absorpcję kryształu fioletowego na 600 nm. Ilość kryształowego fioletu jest proporcjonalna do ilości powstałego biofilmu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trypton	BD	211705
Ekstrakt drożdżowy	BD	212750
Płyta z 96 dołami	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Kwas octowy	Badanie laboratoryjne	PLA00654X	Uwaga: łatwopalne
Czytnik mikropłyt Synergy HT	BioTek