1. Konfokalna mikroskopia laserowa biofilmu A. baumannii S1
1. Hodować hodowlę 5 ml A. baumannii S1 w LB w temperaturze 30 °C w inkubatorze potrząsającym (220 obr./min) przez 16 godzin.
2. Dostosuj kulturę A. baumannii S1 do pożądanego OD600 wynoszącego 0,8. Używając 35 mm szklanej miski μ-Dish, inokuluj hodowlę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do świeżego LB zawierającego 30 μl oczyszczonego enzymu GKL (40 mg/ml); Ostatni tom The New Culture to 1 ml.
3. Przykryj μ-miskę pokrywką i umieść ją w szczelnym plastikowym pojemniku o pojemności 10 L. Inkubuj μ-miskę w 30 °C przez 3 godziny, zanim delikatnie wyjmij podłoże. Dodaj 30 μl oczyszczonego enzymu GKL i świeżego podłoża, co daje całkowitą objętość 1 ml. Inkubuj kolejne 21 godzin w temperaturze 30 °C.
4. Powtórz krok 1,3 i inkubuj μ-Dish przez kolejne 24 godziny w 30 °C. Następnie delikatnie usuń podłoże.
5. Dodaj 500 μl 5 μg/ml aglutininy pszenicy Alex Fluo 488-sprzężonej (WGA) rozpuszczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) do μDish i inkubuj w 37 °C przez 30 minut; To zabarwi powstały biofilm. Usuń roztwór do barwienia i umyj μ-Dish 2 ml HBSS. Powtórz ten krok jeszcze raz.
6. Dodaj 500 μl 3,7% rozpuszczonego w HBSS i inkubuj w 37 °C przez 30 minut; to przywiąże biofilm do μ-Dish. Umyj miskę raz 2 ml HBSS, a następnie całkowicie usuń roztwór. Antena μ-Dish zamocowana biofilmem może być przechowywana w ciemności w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem CLSM.
7. Do obrazowania i analizy CLSM używaj 63-krotnego powiększenia, aby wygenerować 97 stosów na obraz z odstępem 0,21 μm na stos.
