Wykrywanie sacharybakterii w hodowli binarnej za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy

Streszczenie

Źródło: Collins, A. J. i in., Ustanowienie stabilnych binarnych kultur symbiotycznych sacharybakterii z jamy ustnej. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do wykrywania Sacharibakterii w hodowli binarnej z Actinomyces. Protokół opisuje amplifikację DNA oraz elektroforezę żelową w celu potwierdzenia stabilnej interakcji gospodarz z pasożytem.

Protokół

1. Potwierdzenie zakażenia sacharibakteriami za pomocą PCR
   1. Po 5 przejściach potwierdź infekcję reakcją łańcuchową polimerazy (PCR). Pięć przejśćeń zapewni, że wszelkie nierosnące komórki Saccharibacteria zostały wyczerpane poza limitem wykrywalności przy użyciu 25 cykli PCR.
   2. Przygotuj miks PCR. Sugerowany przepis jest następujący: dla każdej potrzebnej probówki przygotować 12,5 μL 2x bufor PCR, 0,75 μL 10 μM Starter Forward (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Zapalnik odwrócony (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl_2, oraz 9 μL wody. Mieszaj przez wirowanie.
   3. Umieść 24 μL mieszanki głównej do lampy PCR o pojemności 0,2 mL. Do reakcji PCR dodaj 1 μL kultury zakażonej Saccharibacteria. Umieść tubę w termocyklerze i wykonaj następujący protokół: początkowa denaturacja w 95 °C przez 5 minut, 25 cykli po 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s, końcowa elongacja przy 72 °C przez 2 minuty, a następnie ostatnie zatrzymanie w 4 °C.
   4. Załaduj i uruchamiaj produkty PCR w żelu agarozowym o stężeniu 1%. Paska ~600 zasad wskazuje na obecność Saccharibacteria.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Brain Heart Infusion Bulion (odwodniony proszek)	Becton-Dickinson	211059	Lub inne podłoże wzrostu odpowiednie dla organizmów docelowych
Zasilacz elektroforezy	Bio-Rad	1645052
Zestaw elektroforezy	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	Albo równoważny termocykler do PCR
Roztwór MgCl₂ 25mM	Promega	A3513
Woda klasy biologii molekularnej	Fisher Scientific	BP2819100
Mikropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Lampy PCR 0,2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Końcówki pipety - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Bejca SYBR Safe DNA Gel	ThermoFisher Scientific	S33102
Tryptyczny bulion sojowy (suszony proszek)	Becton-Dickinson	211825	Lub inne podłoże wzrostu odpowiednie dla organizmów docelowych