$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Podczas całego eksperymentu komórki makrofagów są inkubowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze wymuszonym powietrzem o zawartości 5%CO2 i wyjmowane z inkubatora wyłącznie do eksperymentalnych manipulacji, które wykonuje się w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Praca z bakteriami Listeria monocytogenes odbywa się zgodnie z przepisami biologicznego poziomu 2 bezpieczeństwa.
1. Przygotowanie komórek i infekcja bakteryjna (dni 1 i 2)
- Dzień 1
- Nasion 2,0 x 10 7 komórek makrofagów pochodzących zeszpiku kostnego (BMDM) na naczyniu o średnicy 145 mm w 30 ml BMDM + medium Pen-Strep (Tabela 2). Dla każdego szczepu bakteryjnego do analizy należy zasiać 3 płytki. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wymuszonym powietrzem o stężeniu5% CO2 .
- Rozpocznij nocną hodowlę bakterii szczepu typu dzikiego (WT) L. monocytogenes 10403S w 10 ml infuzji mózgu serca (BHI) w temperaturze 30 °C w standardowym inkubatorze. Umieść rurki hodowli pochylone, bez potrząsania.
UWAGA: Te warunki wzrostu zwiększają ekspresję genów wici, co sprzyja efektywnej infekcji.
- Dzień 2
- Podgrzewane medium BMDM (bez antybiotyków Pen-Strep) (Tabela 2) oraz sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) w temperaturze 37 °C.
- Dwukrotnie przemyj monowarstwę makrofagów 25 ml podgrzanego PBS, aby usunąć antybiotyki. Dodaj 30 ml świeżego medium BMDM.
- Przemyj 1,5 ml nocnej hodowli bakteryjnej PBS, wirując bakterie w > 14 000 x g przez 1 minutę, wyrzucając supernatant i delikatnie zawieszając bakterie w 1,5 ml PBS poprzez pipetowanie. Powtórz dwa razy.
- Zainfekuj każdą płytkę makrofagów 0,5 ml wypłukanej przez noc hodowli dzikiego typu L. monocytogenes. Jeśli używasz wielu płytek, zainfekuj każdą płytkę w odstępie 15 minut. Ten odstęp czasu pozwala na pobranie każdej płytki osobno na końcu infekcji.
UWAGA: Wielokrotność zakażeń (MOI) jest badana przez seryjne rozcieńczenia kultury bakterii używanej do infekcji na płytach agarowych BHI oraz liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) po 24-godzinnej inkubacji płytek w temperaturze 37 °C. Użycie 0,5 ml szczepu WT L. monocytogenes 10403S daje MOI ~ 100 (100 bakterii CFU na komórkę makrofaga). Analizując mutanty bakteryjne wadliwe w wzroście wewnątrzkomórkowym, należy brać pod uwagę wyższy MOI. - Po 0,5 godziny inkubacji w 37 °C przemyj zakażone komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć nieprzyklejone bakterie, i dodaj 30 ml wcześniej podgrzanego medium BMDM. Przymocowane bakterie zinternalizują się w ciągu następnych 0,5 godziny.
- Po godzinie od zakażenia należy dodać 30 μl gentamicyny (1:1 000, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μg/ml), aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe.
- Zestaw aparatu filtracyjnego, umieszczając głowicę filtracyjną na kolbie zbierającej ciecz z portem wylotowym próżniowym. Następnie umieść filtr (0,45 μm) na głowicy filtra, następnie lejek cylindryczny, i zabezpiecz poszczególne części metalową zaciską. Przygotuj lodowatą wodę wolną od RNazy.
- Po 6 godzinach od zakażenia pobieraj bakterie z zakażonych komórek w następujący sposób. Traktuj każdy talerz osobno.
UWAGA: Zazwyczaj L. monocytogenes kończy 1-log wzrostu podczas 6 godzin infekcji w komórkach makrofagów. Dłuższe inkubacje mogą prowadzić do przerostu bakterii i śmierci komórek makrofagów, podczas gdy krótsze okresy inkubacji mogą prowadzić do znacznie niższego obciążenia bakteryjnego. MOI i czas zakażenia można zmodyfikować, aby osiągnąć optymalne warunki.- Umyj zainfekowane komórki PBS raz. Dodaj 20 ml lodowato zimnej wody wolnej od RNazy do komórek makrofagów lizujących. Używając skrobaka do komórek, szybko ale ostrożnie zeskrobaj komórki z płyty.
- Zbierz lizowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wir przez 30 sekund. Wiruj w 800 x g przez 3 minuty w 4 °C.
- Przepuszcz supernatant przez aparat filtracyjny za pomocą systemu próżniowego. Za pomocą pęsety zwiń filtr i szybko przelej go do stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Szybko-zamroź rurki z filtrami w ciekłym azocie.
- Złóż aparat filtracyjny z nowym filtrem do następnej próbki, jak opisano w 1.2.7.
- Przechowuj mrożone filtry w temperaturze -80 °C przez następny dzień. Alternatywnie, przejdź bezpośrednio do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Tabela 1: Protokół reakcji DNazy.
| RNA | do 2 μg (maksymalna objętość 44 μl) |
| 10x bufor DNazy | 5 μl |
| Woda wolna od RNaz | całkowite do 50 μl objętości całkowitej |
| DNAse | 1 μl (1 jednostka) |
Tabela 2: Przepisy na podłoża i bufory.
| 1. Medium 500 ml BMDM + Pen-Strep (sterylizowane filtrem): | |
| Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco | 235 ml |
| Surowica bydła płodowa (FBS) (dezaktywowana 30 minut w temperaturze 54 °C) | 100 ml |
| Czynnik stymulujący kolonię makrofagów lub M-CSF (ośrodek warunkowany L-929) | 150 ml |
| Glutamina | 5 ml |
| Pirorotroczan sodu | 5 ml |
| β-Merkaptoetanol | 0,5 ml |
| Penicylina/Streptomycyna | 5 ml |
| Razem | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (sterylizowany filtrem): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (dezaktywowany po 30 minutach w temperaturze 54 °C) | 100 ml |
| M-CSF (medium kondicjonowane L-929) | 150 ml |
| Glutamina | 5 ml |
| Pirorotroczan sodu | 5 ml |
| β-Merkaptoetanol | 0,5 ml |
| Razem | 500 ml |
| 3. Bufor AE | |
| Octan sodu (NaOAc) pH 5,2 | 50 mM |
| Kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA) | 10 mM |
| Woda wolna od RNaz | |
| 4. fenol-chloroform-IAA | |
| Fenol | 25 ml |
| Chloroform | 24 ml |
| Alkohol izoamylowy | 1 ml |
| 5. chloroform-IAA | |
| Chloroform | 24 ml |
| Alkohol izoamylowy | 1 ml |