Ekstrakcja RNA z Listeria monocytogenes pobranej z zakażonych makrofagów myszy

Streszczenie

Źródło: Sigal, N. i inni. Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowo hodowanej Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje ekstrakcję RNA z Listeria monocytogenes wyizolowanej z zakażonych makrofagów myszy. Protokół ten zachowuje RNA, lizuje komórki za pomocą fenol-chloroformu i ciepła oraz rozdziela RNA przez wirowanie. Sól i etanol, połączone z zimną inkubacją, sprzyjają wytrącaniu RNA. Powstałe RNA wychwytuje ekspresję genów indukowaną przez gospodarza, ujawniając strategie zjadliwości i adaptacji bakterii.

Protokół

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

UWAGA: Wszystkie manipulacje wykonuj roztworami fenolu i chloroformu w okapie oparowym.

1. Przygotuj mieszankę 1:1 zakwaśonego fenolu: chloroform, 400 μl na każdą próbkę. Wymieszaj osobne rurki, a następnie wyciągnij powstałą warstwę wodną przez aspirację. Dodaj 40 μl 10% SDS.
2. Rozmroz rurki zawierające filtr na lodzie, aby utrzymać je w chłodzie. Do każdej probówki zawierającej filtr dodaj 650 μl buforu octanowego EDTA (AE) (50 mM NaOAc pH 5,2, 10 mM EDTA, woda wolna od RNazy).
3. Wykonaj następujące kroki tak szybko, jak to możliwe.
   1. Energicznie przeprowadź rurkę zawierającą filtr, aby filtr przesunął się na obrzeża rurki i bufor całkowicie ją przemył. Zawsze utrzymuj tubę w zimnie, kładąc ją z powrotem na lodzie.
      UWAGA: Może być konieczne dodatkowo przesunięcie rurki do tyłu, aby całkowicie zmyć bakterie z filtra.
   2. Powtarzaj to dla wszystkich lamp. Może być przydatne krótko po zakończeniu procesu ograniczyć zawieszenie (1 minuta przy 120 x g).
4. Przełóż bufor zawierający bakterie do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, zawierającej SDS oraz mieszankę fenol/chloroform. Powtarzaj to dla wszystkich lamp. Może być konieczne ponowne obracanie filtra zawierającego rurki (1 minuta przy 120 x g), aby uzyskać resztkowy bufor z filtra.
5. Wszystkie rurki o pojemności 1,5 ml umieść w wielorurkowym urządzeniu wirującym i wiruj z pełną prędkością przez 10 minut.
6. Inkubuj rurki w bloku grzewczym o temperaturze 65 °C przez 10 minut. Wirówka z maksymalną prędkością (> 14 000 x g) przez 5 minut.
7. Przenieś warstwę wodną (około 400 μl) z każdej probówki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 40 μl 3 M octana sodu (pH 5,2) oraz 1,0 ml etanolu 100%. Dokładnie przefiltruj każdą rurkę.
   UWAGA: Na tym etapie można dodać glikogen, aby poprawić wizualizację wytrąconego pelletu.
8. Inkubuj próbki w temperaturze -80 °C przez godzinę. Alternatywnie, inkubuj próbki w temperaturze -20 °C przez noc. Następnie wiruj próbki w temperaturze 4 °C przez 20 minut z maksymalną prędkością (> 14 000 x g).
9. Ostrożnie zasysaj etanol (górną warstwę) z każdej rurki. Dodaj 500 μl zimnego 70% etanolu do każdej próbki i dokładnie przeprowadź wiry. Wirówka w 4 °C przez 20 minut z maksymalną prędkością (> 1 4 000 x g).
10. Ostrożnie odciągnij etanol z każdej probówki. Susz próbki przez około 2 minuty za pomocą parownika próżniowego bez ogrzewania. Nie przesuszaj próbek.
11. Do każdej próbki dodaj 25 μl wody wolnej od RNazy. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Ostrożnie wiruj i opuszczaj obrót.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Listeria monocytogenes 10403S
H2O, wolne od RNA	Thermo Scientific	10977-015	Można używać wody uzdatnianej DEPC
Nasycone fenolami pH 4,3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Alkohol izoamylowy	Sigma-Aldrich	W205702
Octan sodu	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Absolut etanolu	Merck Millipore	1070174000
Filtry MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Przemysł naukowy	Model G560E
Blok grzewczy 65 °C	Thermo Scientific
Wirówka stołowa 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipety sterylne, 25 ml	Greiner
Rurki Falcon, 50 ml	Greiner
1,7 ml probówek, wolnych od RNazy	Axygen	MCT-175-C
System SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA