$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Uropatogeniczne przygotowanie bakterii Escherichia coli (UPEC)
- Przygotuj szczepionkę na infekcje dróg moczowych (UTI89) (rozpocznij 72 godziny przed dniem szczepienia)
- Rozmazuj UTI89 na płytkę agaru LB (Luria-Bertani) z mrożonego bulionu. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Zbierz kolonię i zaszczep ją w 10 ml LB w kolbce o pojemności 125 ml. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, statycznie.
- Zaszczepić 10 μl hodowli nocnej na 10 ml LB w nowej kolbie 125 ml na dodatkowe 24 godziny w 37 °C, statycznie.
- Przelej 3 ml (różni się w zależności od szczepu i pożądanego rozmiaru inokulum) do sterylnych probarek 1,5 ml, następnie wiruj w 7 000 x g przez 3 minuty, następnie ponownie zawiesij pellet w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wiruj ponownie. Ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 1 mL 1x PBS.
- Zmierz gęstość optyczną bakterii i dostosuj stężenie do pożądanej gęstości inokulum. Standardowe stężenie szczepionki wynosi 10–7 bakterii; jednak może się to różnić w zależności od konstrukcji badania.
2. Szczepienie bakteryjne
- Oczyść stanowisko pracy 70% etanolem i przykryj ten obszar chłonnym papierem (lub użyj sterylnego okapu przepływowego).
- Wlej do 0,9 ml przygotowanego szczepionka bakteryjnego do strzykawki z tuberkulinami (TB) o pojemności 1 ml (usuń pęcherzyki powietrza). Przymocuj przygotowaną sterylną igłę do szczepienia polietylenem o rozmiarze 10 (PE10) rurki na strzykawkę zawierającą inokulum, a następnie sterylnie przycinaj rurkę polietylenową.
UWAGA: Zostaw 1 mm rurki powyżej końca igły, aby nie przebić pęcherza. - Wytnij 1 cal kwadratowy kawałek parafilmu i nałóż na niego odrobinę chirurgicznego lubrykantu (mniej więcej wielkości dziesięciocentówki).
- Znieczulaj samice myszy C3H/HeN, wkładając je do komory waporyzatora (zgodnie z protokołem producenta) aż do utraty przytomności, ale nadal normalnie oddychających (1 oddech/sekunda).
UWAGA: Izofluran to środek doziewnościowy. Stosuj w dobrze wentylowanym miejscu i minimalizuj wdychanie. - Wyjmij mysz z waporyzatora i połóż ją na plecach na ręczniku papierowym, rozkładając nogi.
- Przykryj nos myszy stożkiem nosowym (rurką podłączoną do waporyzatora, która zapewnia kontrolowaną dawkę izofluranu, która jest dostępna w niektórych urządzeniach do waporyzacji), aby utrzymać znieczulenie.
- Delikatnie palpituj pęcherz, aby wywołać oddawanie moczu i upewnić się, że pęcherz jest opróżniony. Wytrzyj okolicę cewki moczowej chusteczką 100% etanolową. Włóż igłę do szczepienia/strzykawkę, najpierw czubkiem, w chirurgiczny lubrykant.
- Zaszczep każdą mysz 50 μl roztworu bakterii, wkładając igłę do inokulacji transuretralnie, około 12 mm, i delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby wprowadzić inokulum do pęcherza (10 μl/s). Wyjmij igłę szczepionkową z myszy.
UWAGA: Natychmiastowy powrót inokulum na otwarciu cewki moczowej podczas rozpoczęcia inokulacji wskazuje na nieprawidłowe lub niepełne wprowadzenie igły. - Wyjmij mysz z nosa i odłóż ją do klatki. Powtarzaj kroki 2.3-2.8 dla każdej myszy. Gdy/zmieniasz warunki szczepu inokulum, wyrzuć strzykawkę i igłę do szczepienia w zatwierdzonym pojemniku na ostre przedmioty i zacznij od kroku 2.2.
UWAGA: Szczepienie uropatogennymi organizmami zazwyczaj nie powoduje silnych objawów bólu. Jednak w rzadkich przypadkach podawanie dużych dawek patogenów może powodować gorączkę, zmniejszenie spożycia jedzenia i wody oraz nieprawidłowe zachowania. Zdrowie zwierząt powinno być monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli zauważone zostaną wyraźne objawy bólu, można podać lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05−0,1 mg/kg podana podskórnie).
3. Enumeracja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych (IBC)
- Aseptycznie usuń pęcherz i umieść go w 1x PBS w 6-dołkowej płycie z silikonowym dnem. Płytki można przygotować przy użyciu zestawu silikonowego elastomeru i wlewając około 1 cm silikonu do każdego dołka. Przetnij pęcherz na pół nożyczkami.
- Używając małych metalowych szpilek, delikatnie rozstaw pęcherz tak, aby jego światło było skierowane do góry. Pamiętaj, aby umieścić piny na najbardziej zewnętrznych krawędziach sekcji pęcherza, aby zapewnić maksymalną ilość urotelu.
- Po rozłożeniu delikatnie przepłucz pęcherz raz za pomocą 1x PBS. Usuń 1x PBS przez pipetę. Napraw pęcherz, dodając tyle 3% paraformalnego dehydu, aby pokryć cały rozłożony pęcherz.
UWAGA: Paraformaldehyd jest rakotwórczy. Należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym rękawice, przez cały czas. Utylizacja powinna być zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi. - Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usuń roztwór paraformaldehydu. Umyj raz z 1x PBS.
- Myj roztworem LacZ (2 mM MgCl2, 0,01% deoksycholatu sodu i 0,02% nonidet-p40 w 1x PBS) trzykrotnie przez 5 minut na każde pranie.
- Usuń roztwór do płukania i dodaj wystarczającą ilość barwnika LacZ (9,5 ml roztworu LacZ, 0,4 ml 25 mg/ml X-gal oraz 0,1 ml 100 mM K-ferrocyjanku/K-ferrycyjandu), aby pokryć pęcherze. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, chroniony przed światłem.
- Wyjmij rozstawione pęcherze z inkubatora i obserwuj IBC, które wyglądają jak niebieskie punkty widziane za pomocą lunetu rozcinającyego, powiększenie 40-60X.
UWAGA: Czasami mysz może oddać mocz przed umieszczeniem rurki pod cewką moczową. W takim przypadku odczekaj 15-20 minut, zanim spróbujesz ponownie zebrać mocz.