Ustanowienie mysiego modelu zakażeń oparzeń patogennymi bakteriami

Streszczenie

Źródło: Wang, Y. i in. In Vivo Badanie terapii przeciwdrobnoustrojowym niebieskim światłem w leczeniu wieloopornych infekcji oparzeń Acinetobacter baumannii z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje, jak zidentyfikować infekcję oparzeniową w modelu myszy, stosując podgrzany mosiężny blok, a następnie patogenne szczepienie bakteryjne. Bakterie kolonizują odsłoniętą macierz zewnątrzkomórkową i tworzą biofilm, umożliwiając badania in vivo interakcji gospodarz-patogen.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Model myszy infekcji oparzeniami wywołanej przez bioluminescencyjny Acinetobacter baumannii

1. Używaj dorosłych samic myszy BALB/c w wieku 7-8 tygodni i ważących 17-19 g. Pozwól myszom przyzwyczaić się do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 3 dni przed rozpoczęciem eksperymentu. Utrzymuj myszy w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności przy temperaturze pokojowej 21 °C i dawaj im jedzenie oraz wodę ad libitum.
2. Znieczulaj myszy za pomocą intraotrzewnowego zastrzyku koktajlu ketaminy i ksylazyny (100 mg/kg-20 mg/kg). Delikatnie dotknij palca każdej myszy patyczkiem watowym; brak odruchu palpebralnego sugeruje odpowiednią głębokość znieczulenia. Oczy myszy pokryj maścią weterynaryjną, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia.
3. Ogol myszy z tyłu, aby odsłonić jak najwięcej skóry, używając maszynki do strzyżenia włosów z 50 ostrzami.
4. Pod odwłokiem każdej myszy umieść pokrywkę 35 mm z miską Petriego, aby ich grzbiety były stosunkowo poziome.
5. Zagotuj wodę w zlewce 250 mL (80% pełnej) na grzewce prądu przemiennego (VAC) o pojemności 10" x 10", 220 V prądu zmiennego. Zanurz mosiężny blok (przekrój 1 cm x 1 cm) w zlewce, aż osiągniesz równowagę termiczną z wodą. Równowaga termiczna zwykle trwa <5 minut i jest oznaczana ponownym zagotowaniem wody w zlewce.
6. Przed powstaniem oparzenia podaj prewencyjnie środki przeciwbólowe (podskórne zastrzyk 0,1 mg/kg buprenorfiny) w celu złagodzenia bólu.
7. Dziesięć minut po prewencyjnych lekach przeciwbólowych delikatnie przyłóż podgrzany mosiężny blok do ogolonego miejsca na grzbiecie myszy przez 7 sekund, aby wywołać oparzenia.
   UWAGA: Aby uniknąć urazów termicznych pracowników, podczas wykonywania procesu wypalania nosz rękawice odporne na termiczność.
8. Podaj 0,5 mL bezpłodnej soli fizjologicznej podskórnie, aby zapobiec odwodnieniu.
9. Pięć minut po wywołaniu urazu termicznego zaszczepić 50 μL zawiesiny bakteryjnej zawierającej 5 x 10⁶ jednostek kolonii (CFU) w soli fosforanowej (PBS) na oparzenia myszy za pomocą pipety. Następnie, używając sterylnego patyczka watowego w zygzakowatym ruchu na skórze, rozsmaruj aliquoty na oparzeniach, aby rozłożyć komórki bakteryjne w poparzonym miejscu jak najrównomierniej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mysz	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 tygodni wieku, 17-19 g wagi
Acinetobacter baumannii	Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX	Izolat kliniczny	Inżynieryjne odkształcenie luminescencyjne
Strzykawki insulinowe	Fisher Scientific	14-826-79	Strzykawki do insuliny BD Lo-Dose U-100 do wstrzykiwania
Chlorek sodu	Fisher Scientific	721016	0,9% chlorku sodu
Sól fizjologiczna z buforem fosforanow, 1x roztwór	Fisher Scientific	BP24384	Standardowy bufor fosforanowy stosowany w wielu procedurach biomolekularnych
Pętle inokulacyjne	Fisher Scientific	22-363-605	Do rozmazywania bakteryjnego inoklu na powierzchni oparzenia myszy
Blok mosiężny	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm na 10 mm	Za tworzenie oparzeń u myszy
Extreme Dragon PBI/Kevlar do wysokiego ciepła	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Rękawice odporne na wysoką temperaturę
Potrawy Greinera	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Cyfrowa płyta grzewcza Corning	Cole-Parmer Instrument Company, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, do wrzenia wody
Myszka/szczur – cienkoliniowe podgrzewane łóżko chirurgiczne	Systemy E-Z	EZ-211	Zapobiega utracie ciepła i hipotermii podczas operacji
Maść weterynarza	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	Maść okulistyczna zapobiegająca suchości oczu