Bioluminescencja ran oparzonych Acinetobacter baumanniii u myszy

Streszczenie

Źródło: Wang, Y. i in. In Vivo Badanie terapii przeciwdrobnoustrojowym niebieskim światłem w leczeniu wieloopornych infekcji oparzeń Acinetobacter baumannii z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje procedurę obrazowania zakażeń ran oparzeniowych u myszy zaszczepionych Acinetobacter baumannii z bioluminescencyjnym operonem. Pokazuje, jak utlenianie podłoża katalizowane lucyferazą wytwarza światło proporcjonalne do obciążenia bakterii, umożliwiając monitorowanie postępu infekcji w czasie rzeczywistym za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Bioluminescencyjne obrazowanie infekcji u myszy

1. Zrób zdjęcia myszy za pomocą systemu obrazowania w słabym świetle, który obejmuje kamerę z wzmocnionym sprzężeniem ładunku, kontroler kamery, komorę próbek oraz procesor obrazu.
2. Znieczulaj myszy za pomocą intraotrzewnowego zastrzyku koktajlu ketaminy i ksylazyny (100 mg/kg - 20 mg/kg). Delikatnie dotknij palca myszy patyczkiem watowym; brak odruchu palpebralnego sugeruje odpowiednią głębokość znieczulenia.
3. Uruchom oprogramowanie do obrazowania na żywo. W panelu sterowania, który się pojawi, kliknij Inicjalizuj. Poczekaj, aż kolor pudełka temperatury zmieni kolor na zielony, co oznacza, że temperatura stopnia w komorze próbki osiągnęła 37 °C.
4. Myszy umieść na scenie (37 °C) w komorze próbki systemu obrazowania, z zakażonymi oparzeniami bezpośrednio pod kamerą.
   UWAGA: Bioluminescencja bakterii może się zmniejszać, gdy oparzenia stają się suche. Dlatego zaleca się nawilżenie oparzeń myszy PBS przed wykonaniem obrazowania.
5. W panelu sterowania zaznacz "Luminescencja". Wybierz "Automatyczna ekspozycja", aby czas naświetlania do obrazowania był optymalizowany przez oprogramowanie obrazujące na żywo w oparciu o intensywność bioluminescencji.
6. Wybierz "C" z rozwijanej listy "Pole widzenia". Wybierz opcję "Skanuj w średnim zakresie", aby oprogramowanie określiło odległość ogniskową. Postaw znaczek obok Nakładka.
7. Kliknij "Zdobyć", aby uchwycić obraz. W polu "Edytuj etykietę obrazu" kliknij "OK"; pojawią się "Okno obrazu" oraz "Paleta opłat".
8. Ustaw parametry Auto ROI dla automatycznego wyboru.
9. Ilościowo określić intensywność bioluminescencji jako względne jednostki luminescencji (RLU) i wyświetlić bioluminescencję w skali fałszywych kolorów od różowego (najbardziej intensywny) do niebieskiego (najmniej intensywny).
10. Oblicz udział przeżywalności bakterii w oparzeniach myszy w różnych punktach czasowych na podstawie analizy intensywności bioluminescencji. Udział przeżywalności bakterii w danym momencie = intensywność bioluminescencji mierzona w tym momencie / intensywność bioluminescencji mierzona tuż przed ekspozycją na niebieskie światło przeciwdrobnoustrojowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Seria III	Przedkliniczne obrazowanie in vivo
Dioda LED dioda LED z diodą ludolującą	VieLight Inc, Toronto, Kanada	415 nm	Źródło światła do oświetlenia
Mysz	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 tygodni wieku, 17-19 g wagi
Acinetobacter baumannii	Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX	Izolat kliniczny	Inżynieryjne odkształcenie luminescencyjne
Potrawy Greinera	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm