Niniejszy protokół opisuje test oparty na aktywności enzymatycznej do wykrywania metaloproteinaz macierzy w nadsączach z kultur komórkowych lub płynach ustrojowych.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy metodą zymografii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metaloproteinazy macierzy (MMPs) są cynkozależnymi endopeptydazami. Degradują one białka poprzez rozszczepianie wiązań peptydowych. Zidentyfikowano ponad dwadzieścia MMP, które są podzielone na sześć grup w zależności od ich struktury i swoistości substratowej (kolagenazy, żelatynazy, MMP typu błonowego [MT-MMP], stromelizyny, matrylizyny i inne). MMP odgrywają kluczową rolę w inwazji komórek, degradacji chrząstki, przebudowie tkanek, gojeniu ran oraz embriogenezie. Uczestniczą zatem zarówno w procesach fizjologicznych, jak i w patogenezie wielu chorób, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, nowotwory czy przewlekła obturacyjna choroba płuc1-6. W niniejszym materiale skupimy się na MMP-2 (żelatynaza A, kolagenaza typu IV), która jest szeroko eksprymowaną metaloproteinazą. Przedstawimy sposób wykrywania MMP-2 w nadsączach z hodowli komórkowych za pomocą zymografii – powszechnie stosowanej, prostej, a zarazem bardzo czułej techniki, opisanej po raz pierwszy w 1980 roku przez C. Heussena i E.B. Dowdle'a7-10. Technika ta jest półilościowa, zatem może być wykorzystana do określenia poziomu MMP w próbkach badawczych, gdy na ten sam żel naniesione zostaną znane stężenia rekombinowanych MMP11.
Roztwory zawierające MMP (np. nadsączki z hodowli komórkowych, mocz lub surowicę) nanosi się na żel poliakrylamidowy zawierający dodecylosiarczan sodu (SDS; w celu linearyzacji białek) i żelatynę (substrat dla MMP-2). Bufor do próbek został opracowany tak, aby zwiększyć lepkość próbki (ułatwiając nakładanie na żel), dostarczyć barwnika śledzącego (błękit bromofenolowy; do monitorowania migracji próbki), dostarczyć cząsteczek denaturujących (do linearyzacji białek) oraz kontrolować pH próbki. Następnie białka migrują pod wpływem prądu elektrycznego w buforze do elektroforezy, który zapewnia stałą szybkość migracji. Odległość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do masy cząsteczkowej białka (małe białka poruszają się przez żel szybciej niż duże, a zatem migrują dalej w głąb żelu). Po migracji żel umieszcza się w buforze renaturującym, aby umożliwić białkom odzyskanie ich struktury trzeciorzędowej, niezbędnej do aktywności enzymatycznej. Następnie żel umieszcza się w buforze wywoławczym, który umożliwia proteazie trawienie jej substratu. Bufor wywoławczy zawiera również octan p-aminofenylortęciowy (APMA) w celu aktywacji nieproteolitycznych pro-MMP do aktywnych MMP. Kolejnym krokiem jest barwienie substratu (w naszym przykładzie żelatyny). Po wypłukaniu nadmiaru barwnika z żelu, obszary trawienia przez proteazę pojawiają się jako jasne prążki. Im jaśniejszy prążek, tym wyższe stężenie zawartej w nim proteazy. Intensywność barwienia prążków można następnie określić za pomocą densytometrii, wykorzystując oprogramowanie takie jak ImageJ, co pozwala na porównanie próbek.
Protokół
1. Nakładanie próbek i prowadzenie elektroforezy
- Wszystkie próbki muszą zostać odpowiednio przygotowane, aby zachować aktywność enzymów, i użyte niezwłocznie po pobraniu lub przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80°C. Próbki nie mogą zawierać czynników redukujących (takich jak β-merkaptoetanol) ani nie mogą być gotowane przed nałożeniem na żel.
- Otwórz opakowanie zawierające żel w kasecie, a następnie wypłucz kasetę wodą dejonizowaną.
- Usuń taśmę ochronną z dołu kasety oraz grzebień z góry żelu.
- Wypłucz dołki trzy razy buforem do elektroforezy (rozcieńczonym do 1X w wodzie dejonizowanej).
- Umieść żel w Mini-Cell, upewniając się, że krótszy bok kasety jest skierowany do wewnątrz. Zablokuj go za pomocą klina do napinania żelu (Gel Tension Wedge). Mini-Cell umożliwia równoległe prowadzenie elektroforezy jednego lub dwóch żeli.
- Napełnij górną (wewnętrzną) komorę buforem do elektroforezy 1X powyżej poziomu dołków i sprawdź, czy nie ma wycieków. W przypadku wycieków usuń bufor i ponownie ustaw żel.
- Napełnij dolną komorę buforem do elektroforezy 1X.
- W jednym dołku nanieś 10 μL markeru masy cząsteczkowej białek.
- Wymieszaj próbkę z równą ilością buforu do nakładania na żel i nanieś do dołków za pomocą końcówek do nakładania próbek (wymienianych po każdej próbce). Do dołków można nanieść łącznie do 20 μL.
- Załóż pokrywę na Mini-Cell i podłącz przewody elektrod do zasilacza. Włącz zasilacz i ustaw stałe napięcie 125 V na 90 minut. Sprawdź, czy na drucie w dolnej komorze tworzą się małe pęcherzyki, co wskazuje na przepływ prądu.
- Podczas prowadzenia pierwszego żelu monitoruj postęp migracji co 15 minut, używając błękitu bromofenolowego zawartego w buforze do nakładania jako wskaźnika. Prowadź elektroforezę do momentu, aż barwnik wskaźnikowy dotrze do dolnej krawędzi żelu.
2. Renaturacja i wywoływanie żelu
- Dla każdego żelu przygotuj 100 mL 1X buforu renaturującego oraz 200 mL buforu denaturującego, oba w wodzie dejonizowanej.
- Gdy barwnik śledzący błękit bromofenolowy dotrze do dolnej krawędzi żelu, wyłącz zasilacz, otwórz Mini-Cell i wyjmij żel. Rozdziel obie strony kasety za pomocą noża do żelu (lub szpatułki do ważenia). Odetnij róg, aby zaznaczyć kierunek żelu.
- Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go w pojemniku z 100 mL buforu renaturującego. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
- Usuń bufor renaturujący i dodaj do żelu 100 mL buforu wywoływującego. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
- Usuń bufor wywoływujący i dodaj do żelu kolejne 100 mL buforu wywoływującego. Inkubuj przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37°C.
- Usuń bufor wywoływujący i wypłucz żel trzy razy (po 5 minut każdy) wodą dejonizowaną przy łagodnym mieszaniu w temperaturze pokojowej.
- Zeskanuj żel, aby zapisać dokładne położenie prążków standardu białkowego, ponieważ po barwieniu żelu staną się one słabiej widoczne lub całkowicie niewidoczne.
- Zbarw żel, dodając do niego 20 mL SimplyBlue Safestain. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
- Usuń SimplyBlue SafeStain i odbarwiaj żel w 100 mL lub większej ilości wody dejonizowanej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
- Aby uzyskać lepsze wyniki, wymień wodę na świeżą wodę dejonizowaną i inkubuj przez kolejną godzinę lub dłużej w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
3. Analiza danych
- Ostrożnie wyjmij żel z wody i umieść go w plastikowej koszulce ochronnej.
- Zeskanuj żel z rozdzielczością 300 dpi lub wyższą. Zapisz obraz w formacie TIFF (Rycina 1A).
- Zmierz intensywność prążków za pomocą programu ImageJ (lub innego podobnego oprogramowania).
- Otwórz plik TIFF w programie ImageJ (Rycina 1A).
- Wyświetl obraz w czerni i bieli, wybierając „Image>Type>8-bit” (Rycina 1B).
- Użyj prostokątnego narzędzia zaznaczania, aby obrysować pierwszy prążek, rysując prostokąt, którego wysokość jest co najmniej dwukrotnie większa niż szerokość (jest to wymóg oprogramowania).
- Naciśnij „1” lub wybierz „Analyze>Gels>Select first lane”, aby obrysować prążek.
- Pojawi się nowy prostokąt; przesuń go na następny prążek i wybierz „Analyze>Gels>Select next lane”. Powtarzaj czynność, aż wszystkie prążki zostaną zaznaczone (Rycina 1B).
- Naciśnij „3” lub wybierz „Analyze>Gels>Plot lanes”, aby wygenerować wykres profilu dla każdego prążka (Rycina 1C).
- Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostych (powinno być już automatycznie wybrane), aby narysować linie bazowe tak, aby interesujący nas pik stanowił całkowicie zamknięty obszar.
- Wybierz narzędzie „wand” (czarodziej) i kliknij wewnątrz każdego piku, aby go zaznaczyć.
- Wybierz „Analyze>Gels>Label peaks”, aby uzyskać tabelę z polem powierzchni każdego zaznaczonego piku. Dane te można przedstawić w formie wykresu (Rycina 1D) lub znormalizować względem wartości wybranego prążka. Normalizacja ta jest szczególnie istotna przy łączeniu wartości z kilku powtórzeń żeli w celu określenia istotności statystycznej wyników.
4. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiamy żel z 11 studzienkami wypełnionymi różnymi supernatantami z hodowli komórkowych, zawierającymi różne ilości MMP-2 (Rycina 1A). Bezpośrednia obserwacja tego żelu wykazuje wyraźne różnice w stężeniach MMP-2 pomiędzy niektórymi studzienkami. Na przykład widać wyraźnie, że studzienki nr 4 i 5 zawierają znacznie więcej MMP-2 niż studzienka nr 11 czy nawet studzienka nr 10. Do obiektywnej kwantyfikacji prążków zastosowaliśmy densytometrię z użyciem oprogramowania ImageJ (Rycina 1B-D), co potwierdziło około 4-krotną różnicę w ilości MMP-2 pomiędzy studzienką nr 11 a studzienkami nr 4 i 5 oraz około 2-krotną różnicę w ilości MMP-2 pomiędzy studzienką nr 10 a studzienkami nr 4 i 5.
Rysunek 1. Detekcja MMP-2 za pomocą zymografii żelatynowej. A, Obraz zeskanowanego żelu żelatynowego. Numery studzienek są wskazane u góry żelu. B, Ten sam żel co w A, przedstawiony w czerni i bieli do analizy densytometrycznej. Każdy prążek został zaznaczony prostokątem w programie ImageJ. C, Dwa przykłady profili densytometrycznych dla żelu przedstawionego w A i B (prążki nr 4 i nr 11). U podstawy każdego piku narysowano linię prostą w celu utworzenia zamkniętego obszaru. D, Wykres pól powierzchni pików dla żelu przedstawionego w A i B przed (lewo) i po (prawo) normalizacji do gęstości prążka nr 1.
Rysunek 2. Ten rysunek demonstruje, w jaki sposób zymografia może być wykorzystana jako technika półilościowa. W 7 kolejnych dołkach naniesiono rozcieńczenia seryjne (kroki rozcieńczeń 1:1) i zmierzono gęstość prążków zarówno dla pro-MMP-2, jak i MMP-2.
Dyskusja
Zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania analizy zymograficznej MMP-2 w supernatantach kultur komórkowych.
Ilość próbki do naniesienia na żel musi zostać określona empirycznie, w zależności od pochodzenia i interesującej nas MMP. Naniesienie zbyt małej ilości uniemożliwi detekcję, natomiast naniesienie zbyt dużej ilości może prowadzić do nasycenia, ponieważ proteaza może strawić jedynie ograniczoną ilość substratu w obszarze prążka. W razie potrzeby próbkę można rozcieńczyć w wodzie dejonizowanej przed zmieszaniem z buforem do nakładania lub skrócić czas wywoływania z całej nocy do 4 godzin. Możliwe jest również zagęszczenie białek w roztworze przy użyciu koncentratorów (np. Millipore katalog nr UFC803024). Jeśli prążki pozostają ledwo widoczne, może być konieczne wywoływanie żeli przez dłuższy czas, nawet do 48 godzin. Przy przygotowywaniu próbek z nadsączów kultur tkankowych należy zwrócić uwagę, że płodowa surowica bydlęca (oraz inne surowice) zawiera MMP, które mogą wpływać na wyniki. Z tego powodu wszystkie nadsącze zbieramy po hodowli w medium wolnym od surowicy.
Przemycia opisane w punktach 2.9 i 2.10 protokołu są niezbędne do usunięcia tła z trawionych prążków. Dłuższy czas przemywania pozwoli usunąć więcej tła, ale spowoduje również osłabienie intensywności barwienia substratu w całym żelu. Jeśli wymagany jest dłuższy czas przemywania, zalecamy skanowanie żelu co kilka godzin, aby wybrać skan o najlepszym kontraście.
Tę technikę można wykorzystać do wykrywania innych MMP. Na przykład MMP-9 można wykryć na żelach żelatynowych, a w mniejszym stopniu również MMP-1, MMP-8 i MMP-13, ponieważ żelatyna nie jest ich preferowanym podłożem. MMP-1 i MMP-13 najlepiej wykrywa się za pomocą zymografii kolagenowej, natomiast kazeina jest preferowanym podłożem dla MMP-11 i pozwala również na wykrycie MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 oraz MMP-139. MMP-7 (matrylizyna) oraz kolagenazy (MMP-1 i MMP-13) są trudne do wykrycia, gdy występują w niskich stężeniach w żelach kazeinowych lub żelatynowych. Dodanie heparyny do próbki w momencie nakładania na żel znacznie poprawia granicę wykrywalności dla MMP-7. W przypadku MMP-1 i MMP-13 heparynę należy dodać do żelu, gdy elektroforeza jest już w toku12.
Ponieważ zymografia mierzy aktywność enzymatyczną po denaturacji i renaturacji enzymów, pozwala ona na oznaczenie aktywności wszystkich MMP obecnych w próbce. Obejmuje to enzymy, proenzymy oraz enzymy związane z inhibitorami endogennymi (np. TIMP-2). Możliwe jest jednak określenie stopnia aktywacji MMP w próbce poprzez porównanie gęstości prążka enzymu aktywnego z gęstością prążka proenzymu, który charakteryzuje się nieco wyższą masą cząsteczkową.
Zymografia często okazuje się niewystarczająca do zidentyfikowania konkretnej MMP. Porównanie poziomu migracji MMP ze znanymi standardami masy cząsteczkowej pomaga w identyfikacji, jednak należy zauważyć, że niektóre z tych standardów zawierają czynnik redukujący i w warunkach nieredukcyjnych mogą wskazywać inną masę cząsteczkową9. Alternatywnym rozwiązaniem jest naniesienie rozpuszczalnej rekombinowanej MMP na ten sam żel co próbki badawcze. MMP mogą jednak wiązać się z innymi białkami, co powoduje zmianę pozornej masy cząsteczkowej. Podczas inkubacji w buforze wywoławczym do żelu (lub części żelu przeciętego na pół) można dodać selektywne inhibitory MMP jako narzędzia farmakologiczne do identyfikacji interesującej nas MMP. W celu potwierdzenia identyfikacji danej MMP zaleca się zastosowanie drugiej techniki (Western Blot, immunocytochemii lub testu ELISA). Należy przy tym pamiętać, że granice detekcji w metodzie Western Blot są często znacznie niższe niż w przypadku żeli zymograficznych, co przy zastosowaniu tej techniki może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować dr. S. Resslerowi (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) za zasugerowanie użycia koncentratorów białek w celu zwiększenia stężenia MMP w nadnadpłynach z kultur komórkowych.
Projekt ten był wspierany przez granty z funduszu badawczego Mrs. Clifford Elder White Graham Endowed Research Fund oraz NIH/NIAMS (AR059838) przyznane CB. Treść opracowania leży wyłącznie po stronie autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko NIH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Xcell SureLock Mini-Cell aparat do elektroforezy w układzie CE | Invitrogen | EI0001 | |
| Zasilacz (model 302) | VWR international | 93000-744 | |
| Żele do zymogramów Novex 10% żelatyny, 1,0 mm, 12 studzienek | Invitrogen | EC61752BOX | |
| Bufor do ładowania żelu Blue Juice | Invitrogen | 10816015 | |
| Końcówki do nakładania próbek na żel | VWR international | 53509-015 | |
| Marker masy cząsteczkowej białek | Invitrogen | LC5800 | |
| Bufor do elektroforezy Novex Tris-Glicyna-SDS | Invitrogen | LC2675 | |
| Bufor renaturujący do zymogramów Novex | Invitrogen | LC2670 | |
| Bufor wywołujący do zymogramów Novex | Invitrogen | LC2671 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Skaner fotograficzny Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | |
| Oprogramowanie ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Autor: W. Rasband, NIH/NIMH |
Bibliografia
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
Przedruki i uprawnienia
