Dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem agrobakterii do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów

Streszczenie

Źródło: Beernink, B. M. i in. Bezpośrednia agroinokulacja sadzonek kukurydzy poprzez wstrzyknięcie klonów zakaźnych wirusa mozaiki lisogona oraz wirusa mozaiki trzciny cukrowej. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje dostarczanie rekombinowanych klonów wirusowych za pośrednictwem Agrobacterium do siewek kukurydzy w celu wyciszenia genów. Opisuje proces zakażenia Agrobacterium , systemowe rozprzestrzenianie się wirusa oraz zmiany fenotypowe wywołane interferencją RNA.

Protokół

1. Iniekcja
UWAGA: Siewki kukurydzy w wieku 4-7 dni mogą być używane do zastrzyków. Tempo wzrostu siewek jest silnie zależne od warunków wzrostu, ilości promieniowania fotosyntetycznego aktywnego (PAR) (czyli wyższego PAR w szklarni niż w komorze wzrostowej) oraz genotypu, a także innych czynników, które mogą być trudne do kontrolowania w warunkach szklarni. Rośliny można wstrzykiwać już w wieku 4 dni, gdy mają 2-3 cm wysokości i nie mają rozwiętych liści, a nawet 7 dni, gdy powiększony jest najniższy liść z zaokrąglonym końcem. Skuteczność tej metody szczepienia gwałtownie spada, gdy rośliny starzeją się ponad 7 dni po wysiewie. Miejsce wstrzyknięcia pozostaje takie samo niezależnie od wieku siewek.

1. Nosząc okulary ochronne, wstrzyknij zawiesinę bakteryjną siewce 2-3 mm powyżej węzła koleoptykalnego, używając igły 25G x 5/8" podłączonej do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 mL.
   UWAGA: Węzeł koleoptylarny to miejsce, gdzie ostatecznie powstają korzenie korony. To najniższy węzeł w zakładzie. Zazwyczaj następuje zmiana koloru z zielonego na biały w miejscu i poniżej węzła. Miejsce wstrzyku znajduje się tuż nad merystemem. Rozcięcie kilku siewek na tym etapie może pomóc w wizualizacji położenia merystenia, a co za tym idzie właściwego miejsca wstrzyknięcia.
2. Delikatnie naciskaj strzykawkę, aż zawiesina wypełni koleoptyl lub stanie się widoczna w zawiłości, w zależności od stadium wzrostu roślin. To około 100-200 μL zawieszenia.
   UWAGA: Jeśli trudno jest wstrzyknąć zawiesinę do siewki, miejsce wstrzyknięcia może być zbyt nisko. Do wstrzyknięcia zawieszenia wystarczy umiarkowane ciśnienie.
3. Wstrzyknij wszystkie siewki, wymieniając strzykawki i igły dla każdego konstrukcjonariusza.

2. Kontynuacja pielęgnacji roślin

1. Przesadź wstrzyknięte sadzonki do doniczek o wymiarach 13 x 13 x 15 cm lub większych, gdy mają 7-8 dni.
2. Utrzymuj warunki wzrostu (16-godzinny okres fotoperiodu i nawożenie raz w tygodniu).

3. Potwierdzenie zakażenia (fenotypowe)

1. Oceny fenotypowo rośliny między 14-21 dniami po szczepieniu (DPI). Zmiany spowodowane wyciszaniem genów kontrolnych ( MIMIC 22 ) lub fitoendesatury można łatwo zauważyć na liściach i różnią się od objawów FoMV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 mL strzykawek	Fisher Scientific	14955450	alternatywnie, BD 309659
Szczep Agrobacterium tumefaciens GV3101			Posiada maszyny do transferu T-DNA kodujące plazmidy wirusowe, RifR, GmR, z materiałów laboratoryjnych
Nawozy			Peters Fertilizer 15-15-15 Koncentrat
Duże garnki	Kordlok	SQL0550	5x5x4" lub większe. Do przesadzania siewek.
Nasiono kukurydzy Golden Bantam Sweet Corn	American Meadows, West Coast Seeds
Podłoże gleby	SunGro Horticulture	SS#1-F1P	Mieszanka słoneczna #1/Fafard-1P, każda mieszanka gleby, w której dobrze rośnie kukurydza, jest wystarczająca