Ustanowienie biofilmów międzykrólestwowych bakterii i grzybów do badania patogenezy jamy ustnej

Streszczenie

Źródło: Schlafer, S, i Frost Kristensen, M. Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzykrólestwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje hodowlę biofilmów Streptococcus mutans i Candida albicans w międzykrólestwowych warunkach w warunkach podobnych do jamy ustnej, aby modelować interakcje bakteria-grzyb, umożliwiając badanie synergii mikroorganizmów, adhezji pośredniczonej glukanem oraz kwasowej zjadliwości w patogenezie jamy ustnej.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IRB instytutu.

1. Uprawa biofilmów międzykrólestwowych

1. Uprawiaj Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 oraz Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 na płytkach agarowych w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych.
2. Przenieś pojedyncze kolonie każdego organizmu do probówek wypełnionych 5 mL infuzji mózgowo-sercowej (BHI). Uprawiaj przez 18 godzin w warunkach aerobowych w temperaturze 37 °C.
3. Wirówka nocnych hodowli w 1 200 x g przez 5 minut. Usuń supernatant, ponownie zawiesij komórki w soli fizjologicznej i dostosuj OD_{550 nm} do 0,5 dla C. albicans (~10^{7 komórek} /mL) i S. mutans (~10^{8 komórek} /mL). Rozcieńcz zawiesinę S. mutans w stosunku 1:10 sterylną solą fizjologiczną (~10^{7 komórek} /mL).
4. Pipeta 50 μL jałowego roztworu ślinowego do wgłębień dolnej płyty optycznej z 96 dołkami do mikroskopii. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przemyj studnie 3 razy 100 μL bezpłodnej soli fizjologicznej. Opróżnić studnie.
5. Do każdego odwiertu dodaj 100 μL zawiesiny C. albicans . Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Myj 3 razy sterylną solą fizjologiczną.
   UWAGA: Nie opróżniaj całkowicie studni podczas mycia. Pozostawić zbiornik o pojemności 20 μL, aby uniknąć nadmiernych sił ścinania.
6. Do każdego dołku dodaj 100 μL surowicy płodowej z inaktywacją termiczną (inaktywowanej w temperaturze 56 °C przez 30 minut). Inkubuj w 37 °C przez 2 godziny. Myj 3 razy sterylną solą fizjologiczną. Opróżnić studnie, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 μL.
7. Do każdego odwiertu dodaj 100 μL zawiesiny S. mutans (przygotowanej w kroku 1.3). Dodaj 150 μL BHI zawierającego 5% sacharozy. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 godziny lub dłużej. Podczas uprawy starszych biofilmów codziennie zmieniaj medium na świeże BHI. Pod koniec fazy wzrostu biofilmu cross-kingdom przemyj 5 razy sterylną solą fizjologiczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki krwioagaru	Statens Serum Institut	677
Wlew do serca mózgu	Oksoid	CM1135
Wlew do serca + 5% sacharozy	Przybory laboratoryjne BDH	10274
Candida albicans	Narodowa Kolekcja Grzybów Patogennych	NCPF 3179
Surowica bydła płodowa	Technologie Gibco Life	10270
Chłodnicza wirówka GS-6R	Beckman	Nie ma
μ-Płyta 96 Studnia	Ibidi	89626
Sterylna sól fizjologiczna	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Spektrofotometr V-3000PC	VWR	Nie ma