$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie płytki krzemowej
- Zaprojektuj geometrię kanału mikrofluidycznego w oprogramowaniu wspomaganym komputerowo (CAD; patrz Tabela materiałów) i wydrukuj ją na przezroczystej folii, aby stworzyć fotomaskę (Rysunek 1A).
- Wykonaj formę główną za pomocą miękkiej litografii (w warunkach czystych pomieszczeni) zgodnie z poniższymi krokami.
- Piecz płytkę krzemową w temperaturze 200 °C przez 2 godziny.
- Umieść płytkę w centrum spin-coatera i wylej na nią fotorezyst SU8 3050 (patrz Tabela materiałów). Spincoat z prędkością 1700 obr./min przez 40 sekund z czasem rampy 10 s/100 obr./min.
UWAGA: Parametry powłoki spinowej zostały ustawione tak, aby uzyskać grubość celu 100 μm dla SU8 3050. - Po procesie powlekania odwracenia miękko wypal płytkę krzemową w temperaturze 65 °C przez 600 sekund i w 95 °C przez 2 700 sekund. Pozwól waflu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez noc.
UWAGA: Nocne chłodzenie zwiększa przyczepność SU8 do płytki. - Umieść fotomaskę (krok 1.1) na waflu i naświetl ją na światło UV, o energii naświetlenia 250 mJ/cm² i długości fali 350 nm.
- Po naświetleniu piecz odsłonięte podłoże w temperaturze 65 °C przez 60 sekund i 95 °C przez 300 sekund.
- Rozwiń płytkę krzemową, aby uzyskać formę główną, zanurzając ją w zlewce wypełnionej wywoływaczem mrDev600 (patrz Tabela materiałów). Delikatnie potrząsaj zlewką przez 1800 sekund, aby wypłukać niepolimeryzowany rezyst. Następnie spryskuj prysk, spryskając płytkę krzemową izopropanolem i susz na powietrzu.
- Twarde pieczenie płytki krzemowej w 200 °C przez 1800 sekund.
- Silanizacja formy głównej poprzez depozycję parową 20 μL trichloro (1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooktyl) (patrz Tabela materiałów) umieszczona na szklanym szkiełku obok formy przez 40 minut w próżniowym desykatorze, tworząc ciśnienie manometryczne 100 mbar.
2. Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego
UWAGA: Opisana tutaj procedura wytwarzania dotyczy urządzenia mikrofluidycznego z jednym kanałem mikrofluidycznym. Jednak tę samą metodę można zastosować do wykonania urządzenia mikrofluidycznego z wieloma równoległymi kanałami mikrofluidycznymi.
- Wymieszaj elastomer z jego siecierem w proporcji 10:1 (patrz Tabela materiałów), aby przygotować mieszaninę polidimetylosiloksanu (PDMS). Mieszaj mieszankę, aż stanie się równomiernie wymieszana i stanie się nieprzezroczysta z powodu zamkniętych pęcherzyków powietrza.
- Odgazowuje mieszankę w próżniowym desykatorze, tworząc ciśnienie manometryczne 100 mbar, aż uwięzione pęcherzyki powietrza zostaną usunięte i będzie wyglądać na przezroczystą. Czas potrzebny na odgazowanie to zazwyczaj 30 minut.
- Umieść główną formę (krok 1) w misce do hodowli komórkowej (patrz Tabela materiałów). Wylej 20 g mieszanki PDMS na formę główną, aby uzyskać kanały o ostatecznej grubości 5 mm.
- Piecz formę główną w 70 °C przez 2 godziny.
- Wytnij utwardzone PDMS wokół kanału mikrofluidycznego (w odległości około 3 mm) za pomocą ostrza, a następnie odklej kanał mikrofluidyczny PDMS z formy głównej.
- Aby stworzyć wlot i wylot kanałów mikrofluidycznych, należy wybić otwory wybiórką biopsyjną (średnica 1,5 mm) na ich końcach (górna część trójkątów, patrz Rysunek 1A). Wybij jeszcze jeden otwór w centrum trójkąta wlotowego, aby później zamontować czujnik ciśnienia.
- Umyj szklaną szkiełkę i kanał mikrofluidyczny w dostępnym komercyjnie 1% roztworze detergentu (patrz Tabela materiałów) przez 5 minut, a następnie płucz je wodą dejonizowaną. Następnie przemyj kanał mikrofluidyczny PDMS oraz szkiełko izopropanolem. Następnie ponownie je opłucz wodą dejonizowaną. Susz kanał mikrofluidyczny PDMS, a szkło ślizgowe sprężonym powietrzem na 1 barze przez 1 minutę.
UWAGA: Porowata struktura PDMS musi być całkowicie sucha, aby wiązanie było skuteczne. - Umieść szkiełko szkiełkowe i kanał mikrofluidyczny w środku do czyszczenia plazmy (patrz Tabela materiałów) i upewnij się, że powierzchnie do łączenia są skierowane do góry. Włącz oczyszczacz plazmowy i obdaż kanał mikrofluidyczny oraz szkiełko plazmą powietrzną z przepływem powietrza 1 SL/h (standardowy litr na godzinę) przez 1 minutę. Natychmiast po wyjęciu ze środka do środka sklejowego sklej mikrofluidyczny sklej kanał mikrofluidyczny, łącząc je ze sobą.
UWAGA: Upewnij się, że nie dotykasz powierzchni impregnowanych, ponieważ może to wpłynąć na klejenie. Podczas wykonywania urządzenia mikrofluidycznego z wieloma kanałami mikrofluidycznymi eksponuj kanały mikrofluidyczne jednocześnie i łącz je w jednym kroku. - Umieść połączone urządzenie mikrofluidyczne na płycie gorącej o temperaturze 80 °C na co najmniej 15 minut.
- Przechowuj urządzenie mikrofluidyczne w czystej misce do hodowli komórek do czasu rozpoczęcia eksperymentu.
3. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
- Hodować populację Bacillus subtilis NCIB 3610 przez 20 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu, bezpośrednio zaszczepiając 3 mL odżywczego bulionu nr 3 (patrz Tabela materiałów) z mrożonego bulionu glicerolowego w probówce hodowlanej 15 mL. Inkubuj w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 30 °C i 200 obr./min przez noc (przez 16 godzin).
- Z nocnej hodowli przygotuj podkulturę 4 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, dodając 3 μL tej nocnej kultury w 3 mL świeżego medium (rozcieńczenie 1:1 000) w probówce hodowli o pojemności 15 mL. Inkubuj subkulturę w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 30 °C przy 200 obr./min przez 3,5-4 godziny, aby uzyskać gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) równą 0,1.
4. Eksperyment wzrostu biofilmu
- Włącz inkubator pudełkowy mikroskopu 3 godziny przed eksperymentem, aby zapewnić stabilną temperaturę 25 °C. Zamontuj pompę strzykawkową i czujniki ciśnienia (patrz Tabela materiałów).
- Podłącz rurkę wlotową i wylotową do urządzenia mikrofluidycznego. Bezpośrednio włóż igłę (o średnicy zewnętrznej 0,6 mm) do rurki wlotowej, aby zabezpieczyć połączenie między rurką a strzykawką.
- Umieść urządzenie mikrofluidyczne, 30 mL wody dejonizowanej i 30 mL pożywki hodowlacyjnej w próżniowym desykatorze i odgazuj je przez co najmniej godzinę. Następnie powoli przesuwaj medium hodowlane i zdejonizowaną wodę do dwóch oddzielnych strzykawek po 30 mL.
UWAGA: Ten krok jest kluczowy, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków w kanale podczas przepłukiwania podłożem hodowlanym. - Zamontuj urządzenie mikrofluidyczne na mikroskopie i umieść rurkę wylotową w pojemniku na odpady.
- Podłącz strzykawkę wypełnioną wodą dejonizowaną do kanału mikrofluidycznego przez rurkę mikrofluidyczną i powoli wstrzykuj wodę, aż wyjdzie ona z wylotu czujnika ciśnienia. Napełnij czujnik ciśnienia wodą i przepłucz wszystkie pęcherzyki z rurki łączącej kanał mikrofluidyczny z czujnikiem ciśnienia. Zamknij wylot czujnika ciśnienia za pomocą śrub przeznaczonych do czujnika ciśnienia.
UWAGA: Opisana procedura napełniania zapewnia, że zmiany ciśnienia na wejściu kanałów mikrofluidycznych będą precyzyjnie rejestrowane. Podczas eksperymentu z wieloma kanałami mikrofluidycznymi podłącz każdy kanał do osobnej strzykawki, aby zapewnić równe warunki przepływu we wszystkich kanałach.
- Wypełnij resztę kanału mikrofluidycznego wodą zdejonizowaną.
- Umieść filtr 1,2 μm (patrz Tabela materiałów) na strzykawkę mediów hodowlanych. Następnie wyjmij strzykawkę z wodą i ostrożnie podłącz strzykawkę do rurki mikrofluidycznej na wlocie. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i przepłucz kanał podłożem hodowlowym z przepływem 2 mL/h przez 1 godzinę.
UWAGA: Filtr zapobiega przedostawaniu się komórek bakteryjnych do strzykawki podczas ładowania. Przepłukanie kanału mikrofluidycznego z medium hodowlanym usunie pozostałe pęcherzyki w strukturze porowatej. - Podczas eksperymentu ustaw pompę strzykawkową na pożądany przepływ (tutaj 1 mL/h) i ustaw odczyt ciśnienia czujników ciśnienia na zero.
UWAGA: Ustawiając początkowy odczyt ciśnienia na zero, zmierzona zostanie jedynie różnica ciśnień spowodowana wywoływaniem biofilmu podczas eksperymentu. - Pipeta 1 mL hodowli bakteryjnej przy przedawkowaniu 0,1 ml do fiolki wirówki o pojemności 1,5 mL. Załaduj hodowlę bakterii do kanału mikrofluidycznego, umieszczając rurkę wylotową do fiolki wirówki. Po odczekaniu 5 minut na usunięcie potencjalnych pęcherzyków powietrza z wylotu rurek należy pobrać 150 μL roztworu bakteryjnego z przepływem 1 mL/h, aż kanał mikrofluidyczny zostanie wypełniony hodowlą bakteryjną.
- Ostrożnie wyjmij filtr strzykawki z medium hodowlanego i umieść wylot do pojemnika na odpady. Pozostawić komórki bakteryjne w warunkach zerowego przepływu w kanale mikrofluidycznym przez 3 godziny, aby umożliwić ich przyczepienie powierzchni do ośrodka porowatego.
UWAGA: Pozostawienie komórek bakteryjnych w warunkach zerowego przepływu przez 3 godziny było zoptymalizowane pod kątem przyczepienia używanego szczepu bakteryjnego, jednocześnie zapewniając dobrze natlenioną hodowlę bakteryjną. Inne szczepy bakteryjne mogą wymagać więcej lub mniej czasu. - Aby rozpocząć eksperyment, rozpocznij przepływ, ustawiając pompę strzykawkową na pożądany przepływ (tutaj 1 mL/h) i rozpocznij pomiar ciśnienia od 1 Hz.
- Zrób zdjęcia rosnącego biofilmu w pożądanych przedziałach czasowych, konfiguracji optycznej i powiększenia.
UWAGA: W niniejszym badaniu co 6 minut przez 24 godziny wykonywano zdjęcia z 4x powiększeniem w trybie jasnego pola w 18 pozycjach, obejmujących całą domenę porowatego ośrodka.
