Mikroskopowa ocena przyczepienia bakterii do powierzchni korzeni roślin

Abstract

Źródło: Matthysse, A. G. Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje ocenę przyczepienia bakterii do korzeni roślin za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Najpierw montuje się próbki korzeni z sadzonek inkubowanych z bakteriami, aby sprawdzić obecność wolnych bakterii. Następnie próbki są myte, aby usunąć luźno przyczepione bakterie, a następnie ponownie montowane za pomocą odpowiedniego pokrywa, aby zapobiec uszkodzeniom. Na koniec pod mikroskopem liczy się liczbę bakterii przyczepionych do włoski korzeniowych.

Protocol

1. Szczepienie bakterii

1. Określ liczbę bakterii do zaszczepienia w zależności od pomiaru użytego do określenia adhezji bakterii oraz długości czasu inkubacji.
2. W badaniach mikroskopowych z czasem inkubacji krótszym niż 1 dzień należy zaszczepić stosunkowo dużą liczbę bakterii. Dodaj odpowiednią ilość hodowli, aby uzyskać końcowe stężenie bakterii przekraczające 10–⁶ bakterii na mL. Aby wydłużyć czas inkubacji, zmniejszaj rozmiar inokulum bakteryjnego.
3. W badaniach, w których adhezja bakteryjna jest mierzona na podstawie liczby żywotnych komórek, należy dodać ilość hodowli, aby uzyskać końcowe stężenie bakterii 10^do 10^{6 bakterii} na mL.
4. Unikaj dodawania tylu bakterii, że ich metabolizm zmienia pH lub stężenie tlenu w podłożu inkubacyjnym. Zmierz pH za pomocą papieru pH lub elektrody. Zmierz stężenie tlenu za pomocą elektrody tlenowej.
5. Rośliny uprawiane w piasku zaszczepić na trzy możliwe sposoby.
   1. Zaszczep nasiona bakteriami przed sadzeniem, mocząc je przez 1 minutę w zawiesie w wodzie o stężeniu około 10–⁶ bakterii na mL.
   2. Zaszczep korzeń poprzez kiełkowanie siewek aksenowych. Gdy korzeń siewki ma około 1 cm długości, zanurz ją lub umieść całą sadzonkę w zawiesie 10–⁶ bakterii na ml w wodzie na 1 minutę.
   3. Zaszczep piasek, mieszając bakterie z piaskiem przed sadzeniem, aby uzyskać końcowe stężenie około 10–³ bakterii na mL lub podlewając siewkę zawiesiną 10–⁶ bakterii na mL po sadzeniu.

2. Inkubacja bakterii z materiałem roślinnym

1. Do inkubacji w podłożu ciekłym inkubuj bakterie z materiałem roślinnym w wodzie sterylnej lub sacharozie i solach mineralnych lub podłożu do hodowli tkanek roślinnych (np. rozcieńczeniu 1:10 mieszaniny soli bazalnej Murashige i Skoog lub soli MS).
   1. Użyj pojemnika, do którego bakterie się nie przyczepiają. Staraj się utrzymywać powierzchnię rośliny zakrytą stale, zanurzając lub delikatnie mieszając. Intensywne mieszanie może zapobiec przyrostom lub nawet usunąć bakterie z powierzchni rośliny.
   2. Obserwuj materiał roślinny pod mikroskopem świetlnym po różnych odstępach czasu, aby określić, kiedy zatrzymać inkubację i wykonać pomiary. Czasem trwania adhezji jest często cenny – próbki pobierane są co 1 do 4 godzin lub codziennie, w zależności od szybkości interakcji.
2. Aby inkubować w piasku, należy stosować te same kryteria, co opisane dla inkubacji w ciekłym medium w kroku 2.1.

3. Pomiar przyczepności za pomocą mikroskopu

1. Wykonuj pomiary mikroskopowe za pomocą optyki Nomarskiego lub kontrastu fazowego, aby łatwiej obserwować bakterie na powierzchniach. Jednak można użyć dowolnego mikroskopu jasnego pola z powiększeniem 20X lub większym.
   1. Użyj obserwacji mikroskopowej, aby określić, czy bakterie są losowo rozmieszczone lub zlokalizowane w określonych miejscach. Sprawdź też, czy są powiązane pojedynczo, czy w klastrach. Szukaj obecności mikrokolonii sugerujących wzrost lub uwięzienie bakterii po zrostu. Sprawdź, czy bakterie nie tworzą biofilmu na powierzchni.
      UWAGA: Biofilm to duża liczba bakterii związanych z powierzchnią i otoczonych matrycą zewnątrzkomórkową. Struktura może być gładka i jednolita lub mieć bardziej skomplikowaną architekturę.
   2. Używaj bakterii oznaczonych markerem fluorescencyjnym. Jeśli obecne są inne bakterie, a interesujące bakterie są identyfikowane za pomocą znaku fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić obecność oznakowanych bakterii w skupiskach innych bakterii. Dla GFP użyj filtra o wzbudzeniu 490 nm i emisji 520 nm.
      1. Sprawdź, czy znacznik fluorescencyjny nie wpływa negatywnie na bakterie, obserwując przyleganie do materiału aksenicznego równej mieszaniny bakterii dzikiego typu i oznaczonych bakterii tego samego szczepu, używając zarówno optyki Nomarskiego, jak i fluorescencyjnej. Jeśli bakterie fluorescencyjne i ciemne są losowo wymieszane i występują w równych ilościach, oznacza to, że tag nie zakłócał testu.
2. Określ liczbę przyczepionych bakterii.
   UWAGA: Bardzo trudno jest określić liczbę przyczepionych bakterii w mikroskopie. Gdy wiązanie dotyczy nieregularnych powierzchni roślin, zazwyczaj nie jest możliwe uzyskanie ilościowego pomiaru. Mikroskopia elektronowa skaningowa (nie omawiana w tym artykule) może być stosowana do takich pomiarów.
   1. Gdy bakterie zostaną związane z gładką powierzchnią, taką jak włosek korzeniowy, policz liczbę bakterii związanych z krawędzią włoska korzeniowego na milimetr długości włoska korzeniowego. Uważaj, aby używać włosków korzeniowych o podobnej wielkości i kształcie do porównywania wymiarów.
   2. Aby określić rozmiar obiektów w mikroskopie, użyj komercyjnego szkiełka z mierzonymi oznaczeniami. Obserwuj i fotografuj ten slajd w tych samych ustawieniach, co użyto do materiałów eksperymentalnych, a uzyskane obrazy wykorzystaj do określenia rozmiaru obiektów na fotomikrografiach.
3. Przygotuj próbkę do mikroskopii.
   1. Przemyj próbkę. Przenieś próbkę do kropli wody lub pożywki inkubacyjnej na szkiełku mikroskopowym i obserwuj ją bezpośrednio.
      UWAGA: Ma to tę zaletę, że jeśli nie nastąpił wzrost bakterii ani faktyczna śmierć bakterii, prawdopodobnie nie byłoby wielu wolnych bakterii. Brak wolnych bakterii traktuj jako sygnał ostrzegawczy, że mogła dojść do śmierci lub wiązania się bakterii z pojemnikiem, w którym przeprowadzono inkubację. Efekt mycia próbki przedstawiono na Rysunku 1.
   2. Delikatnie myj próbkę w wodzie lub pośrodku inkubacyjnym, umieszczając ją w fiolce z płynem i delikatnie odwracając fiolkę. Następnie umieszczamy próbkę na szkiełku mikroskopu w świeżej cieczy do obserwacji.
   3. Zamontuj próbkę w cieczy za pomocą zwykłej powłoki osłonowej i szkiełka mikroskopowego.
      1. Jeśli próbka jest gruba i powoduje wypukłość pod okładką, użyj naklejającej pokrywki z prasowaniem. Te pokrywy mają wokół krawędzi pokrywy pierścień z gumy lub plastiku. Włóż płyn i próbkę do studni na slipie pokrywkowym, a następnie umieść szkiełko na wierzchu i delikatnie dociśnij, aby uszczelnić slip do szkiełka. Odwróć i zbadaj.
      2. Alternatywnie, użyj zjeżdżalni do liczenia glonów i osłony pokrywającej w podobny sposób. Należy zauważyć, że preparaty o takiej głębokości zazwyczaj nie mogą być badane obiektywem o większym niż 20x powiększeniu.

Results

Rysunek 1: Kroki w przygotowaniu próbki do określenia liczby związanych bakterii. Agrobacterium tumefaciens wiąże się z włoskimi korzeniowymi pomidora (A, B i C) oraz z nylonowymi nitkami (D, E i F). W próbkach zamontowanych w wodzie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop świetlny	dowolny	Nie ma	Pomocne są kontrasty fazowe lub optyka Nomarskiego, a do badań z markerami fluorescencyjnymi wymagany jest mikroskop fluorescencyjny.
Nasiona	dowolny	Nie ma	Zanotuj numer partii nasion i odmianę
Wybielacz	dowolny	Nie ma
Sonikator kąpielowy	Każda firma zajmująca się zaopatrzeniem naukowym	Nie ma
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Agar odżywczy	Difco	2001-01-08
Soytone	Difco	24360
Piasek	morski piasek Fisher Scientific	S25
Piasek	Sigma-Aldrich	S9887
Pojemniki	Stuewe & Sons, Inc.	Ray-Leachowe stożkowe zastawy	Dostępnych jest wiele różnych rozmiarów, dostosowanych do rodzaju rośliny, którą chcesz uprawiać
Parafilm	Każda firma zajmująca się zaopatrzeniem naukowym	Nie ma
Sole MS	Sigma-Aldrich	M5524
Komórka licząca krokwie Sedgwicka	Hauser Scientific	HS3800
Komora inkubatynowej z klipsem i klipsem	Sigma-Aldrich	Z359483
Ryfampycyna	Sigma-Aldrich	R3501