Tworzenie ziaren stresowych podczas infekcji komórek nabłonka nowotworowego Shigella

Streszczenie

Źródło: Vonaesch, P. i in., Analiza immunofluorescencji powstawania ziaren stresowych po bakteryjnym wyzwaniu komórek ssaków. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje zakażenie komórek nabłonkowych patogenną bakterią Shigella flexneri oraz powstałą w wyniku tego odpowiedź komórkową gospodarza. Bakteryjne białka efektorowe zakłócają translację gospodarza, wywołując powstawanie organelli bez błony zwanej granulami stresowymi, które odzwierciedlają adaptacyjną odpowiedź komórki na infekcję.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii i komórek gospodarza

1. Przenosi się szklane pokrywy o średnicy 12 lub 14 mm odpowiednio w płytkach z 24 lub 12 dołkami, sterylną pęsetą, licząc po jednym dołku na każdy stan eksperymentalny. Sterylizuj je za pomocą ultrafioletowego (UV) zabiegu w okapu do hodowli tkanek przez 15 minut.
   UWAGA: Uwzględnić dołki kontrolne dla wyzwań bakteryjnych oraz dla indukcji granulacji stresu (SG) przez stresy egzogenne.
2. Dla płyty z 24 dołkami i pokrywkami o średnicy 12 mm, należy zasiać 1 x 10^{komórek ssaków} (np. komórek HeLa) na pokrywkach; Dociskaj pokrywki sterylnym końcówką pipety. Pozwól komórkom przyjrzeć się przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkanek 5%_CO2 w pożywce odpowiedniej dla każdego typu komórek.
   UWAGA: Komórki płytowe tak, aby zbieżność komórek następnego dnia wynosiła od 40 do 60%.
   1. Dla komórek HeLa inkubuj w zmodyfikowanym ośrodku Eagle (DMEM) Dulbecco z aminokwasami nieistotnymi (NEAA) oraz 10% dekomplementowanym surowicom cielęcia płodu (FCS). Odłącz FCS, podgrzewając przez 30 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C, mieszając surowicę raz po 15 minutach.
3. Aby usunąć bakterie, użyj sterylnej końcówki pipety, aby usunąć niewielką ilość z bakteryjnego bulionu glicerolowego (20% glicerolu) przechowywanego w zamrażarce o temperaturze -80 °C i umieścić go na oznaczonej tacyce. Użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić bakterie na około 10% płytki. Użyj nowej sterylnej pętli i przeciągnij ją przez rozmazanie, aby zrobić 3 równoległe linie o długości pół płytki. Przesuwaj się przez te linie, zakrywając resztę płyty. Inkubuj płytkę O/N w temperaturze 37 °C.
   1. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną (np. Shigella flexneri) z świeżo prążkowanej płytki. Unikaj pracy z koloniami bakteryjnymi starszymi niż tydzień.
   2. Dla szczepu S. flexneri M90T zaszczep czerwoną kolonię z świeżo prążkowanego tryptycznego agaru sojowego 0,1% Konga w 8 mL bulionu sojowego tryptycznego w probówce o pojemności 15 mL; Dokręć pokrywkę i inkubuj wstrząsanie przy 222 obr.min O/N przy 30 °C. UWAGA: Nie używaj dużych białych kolonii, ponieważ utraciły plazmid zjadliwości i są niezakaźne.

2. Bakteryjne wyzwanie komórek gospodarza

1. Przygotuj bakterie, aby zmaksymalizować potencjał zakażenia.
   1. Dla S. flexneri podhoduj bakterie poprzez dodanie 150 μL O/N do 8 mL tryptycznego agaru sojowego i inkubuj wstrząsanie przy 222 obr./min w 37 °C do późnej fazy wykładniczej (~2 godziny), aby wywołać ekspresję genów i zwiększyć infekcję.
      1. Gdy hodowla ma gęstość optyczną między 0,6 a 0,9 (mierzona na 600 nm), przelej 1 mL hodowli do probówki o pojemności 1,5 mL. Bakterie z pelletami przez 2 minuty przy 8 000 x g i ponownie zawiesinują w podłożu zakaźnym (DMEM z NEAA, brak FCS) przy OD₆₀₀ = 1. Zatem jeśli OD₆₀₀ wynosi 0,85, zawiesz ponownie w 850 μL.
         UWAGA: Dla S. flexneri, przy OD₆₀₀ = 1, po hodowli w podłożu 8 mL będzie 8 x 10⁸ bakterii na mL. Odpowiednia jest wielokrotność zakażeń (MOI) 20. W przypadku innych patogenów liczba bakterii na mL przy OD₆₀₀ oraz odpowiedni MOI muszą być określone empirycznie.
   2. Aby wzmocnić interakcje bakteria-gospodarz, pokryj bakterie poli-L-lizyną (PLL).
      UWAGA: Leczenie PLL S. flexneri nie miało wpływu na dynamikę SG. Inne patogeny wymagają oceny pod kątem ich podatności na leczenie PLL.
      1. Aby pokryć bakterie PLL, wiruj 1 mL hodowli bakterii przez 2 minuty przy pojemności 8 000 x g, a następnie ponownie zawiesij pellet w 10 μg/mL PLL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przy przedawkowaniu₆₀₀ = 1.
      2. Dodaj roztwór bakteryjny do małej miseczki, takiej jak studnia w 12-dołkowej płycie, i inkubuj w RT (~ 20 °C) przez 10 minut, delikatnie mieszając na potrząsaczce do talerza.
      3. Bakterie granulatowe przez 2 minuty przy 8 000 x g, usuń nadmiar PLL. Ponownie zawiesz granulek w 1 mL PBS i powtórz ten krok mycia dwa razy. Po końcowym płukaniu ponownie zawiesić w podłożu infekcyjnym przy przedawkowaniu₆₀₀ = 1.
         UWAGA: Tutaj pożywką zakażenia dla S. flexneri jest pożywka z komórek gospodarza zawierającą 20 mM N-(2-hydroksetylo)piperazyny-N'-(2-kwasu etansulfonowego) (HEPES) bez FCS.
2. Przygotuj komórki na ryzyko bakteryjne.
   1. Usuń medium z komórek HeLa ssaków za pomocą pompy ssącej. Dodaj 500 μL podłoże komórkowe RT HeLa do przemytnia komórek, zamieszaj, usuń medium za pomocą pompy ssącej i zamień go odpowiednim medium o temperaturze pokojowej (RT) o temperaturze 500 μL (np. medium komórkowym z 20 mM HEPES bez FCS).
   2. UWAGA: We wszystkich etapach mycia pracuj szybko i przetwarzaj maksymalnie 4 pokrywki jednocześnie, aby nie wysuszyć komórek.
3. Challenge przygotował komórki HeLa z bakteriami, aby zainfekować 20-50% komórek.
   UWAGA: Odpowiedni czas i MOI należy określić dla każdego gatunku bakterii. Zazwyczaj dobry początek to 30 minut w 37 °C z MOI 10.
   1. W przypadku S. flexneri podważ komórki HeLa za pomocą jednej z dwóch metod (krok 2.3.1.1 lub 2.3.1.2).
      1. Spenduj bakterie nieobjęte PLL (20 μL OD₆₀₀ = 1 na włon płytki 24-dołkowej w medium 500 μL) na komórkach przez 10 minut w 13000 x g.
      2. Dodaj bakterie pokryte PLL (15 μL OD₆₀₀ = 1 na włon płytki 24-dołkowej w medium 500 μL) przez 15 minut w RT, aby umożliwić bakteriom osiedlenie się na komórkach.
   2. Pozwól na zakażenie, umieszczając komórki z osiadłymi bakteriami w inkubatorze do hodowli tkanek o temperaturze 37 °C na 30 minut.
      UWAGA: Na krótkie czasy synchronizuj infekcję S. flexneri , umieszczając płytki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut zamiast w inkubatorze do hodowli tkanek.
4. Zatrzymaj infekcję, myjąc komórki.
   1. Aby przepłukać komórki i usunąć nadmiar bakterii, usuń podłoże za pomocą pompy ssącej, dodaj 1 ml świeżego, podgrzanego (37 °C) medium hodowlanego HeLa (DMEM, 10% FCS, NEAA). Wymieszaj podłoże, usuń i zamień na świeże podłoże. Powtórz dwa razy i pozostawij świeże podłoże na komórkach.
      1. W przypadku S. flexneri lub innych bakterii wewnątrzkomórkowych, po zakażeniu komórkami HeLa i płukaniami, zamień podłoże standardowym pożywką do hodowli tkankowej zawierającą 50 μg/mL gentamicyny, aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe i zapobiec dalszej inwazji komórek.
         UWAGA: Nie dodawaj antybiotyków do podłoża na bakterie zewnątrzkomórkowe.
5. Inkubuj bakterie z komórkami przez określony czas w inkubatorze do hodowli tkankowej.
   UWAGA: W przypadku S. flexneri zakażenie może trwać nawet 6 godzin, w zależności od typu komórki. W przypadku komórek HeLa pozwól infekcji trwać 1,5–2 godziny, zanim dodasz egzogeniczne naprężenia, aby wywołać powstawanie SG. W przypadku zakażeń Caco-2, w których Shigella rozprzestrzenia się z komórki na komórkę, zakaż przez 30 minut do 6 godzin, zanim dodasz stres egzogenny. Komórki można utrwalić w tym momencie bez dodawania egzogennych stresów, aby ocenić powstawanie SG w wyniku infekcji bakteryjnej.

3. Analiza fiksacji i immunofluorescencji powstawania ziaren naprężonych

UWAGA: Przetwarzaj jednocześnie pokrywki kontrolne i eksperymentalne, aby uniknąć różnic barwiących, które mogłyby wpłynąć na analizę obrazu w kolejnych etapach. Próbki kontrolne nie zawierają infekcji ani z ani bez leczenia indukującego SG, a także zakażone próbki z lub bez leczenia indukującego SG.

1. Usuń podłoże całkowicie za pomocą pompy ssącej i zabezpiecz próbki, dodając 0,5 mL RT 4% paradehydu (PFA) do PBS. Inkubuj przez 30 minut w RT.
   UWAGA: PFA szkodzi opiekunowi i środowisku. Podejmuj odpowiednie środki ochrony osoby prowadzącej i utylizację odpadów chemicznych.
   UWAGA: Alternatywnie, utrwal przez 15 minut, a następnie zastąpił metanolem schłodzonym na 10 minut w temperaturze -20 °C, aby zachować większą lokalizację cytoplazmatyczną markerów SG.
2. Usuń PFA pipetą i wyrzuć płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady. Przemyj pokrywkę 1 mL soli fizjologicznej z trisbuforem (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM chlorku sodu, NaCl). Inkubuj slip przez 2 minuty, delikatnie potrząśnij na talerzu podczas mycia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Shigella flexneri			Dostępne w różnych laboratoriach na życzenie
Bulion z tryptone, kazeiny sojowej (TCS)	BD Biosciences	211825	Standardowe podłoże dla Shigelli, aplikacja – wzrost bakterii
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standardowy agar wzrostu dla Shigelli, zastosowanie – wzrost bakterii
Kongo czerwony	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Narzędzie do rozróżniania dla Shigelli , które utraciło plazmid zjadliwości, zastosowanie – wzrost bakterii
Poli-L-Lizyna (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Przydatne do powlekania bakterii w celu zwiększenia infekcji, zastosowania - infekcji
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selektywne zabijanie bakterii zewnątrzkomórkowych, ale nie cytosolowych, zastosowanie – infekcja
HEPES	Technologie życia	15630-056	Bufor pH jest przydatny, gdy komórki są inkubowane w RT, zastosowanie – hodowla komórkowa
Zmodyfikowany medium Eagle (DMEM) firmy Dulbecco	Technologie życia	31885	Standardowe medium hodowlane dla komórek HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa
Serum łydki płodu (FCS)	Biowest	S1810-100	Suplementacja 5% stosowana do podłoża HeLa dla hodowli komórek, zastosowanie - hodowla komórkowa
Aminokwasy nieistotne (NEAA)	Technologie życia	11140	Rozcieńczenie 1:100 stosowane w pożywce hodowli komórek HeLa, zastosowanie - hodowla komórkowa
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Rozcieńczalnik odczynnikowy, zastosowanie – hodowla komórkowa
Paraformaldehyd (PFA)	Scence mikroskopii elektronowej	15714	4% PFA stosuje się do standardowej fiksacji komórek, zastosowanie – fiksacja
Płytka hodowla komórek z 24 dołkami	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standardowe płytki do hodowli tkankowych, zastosowanie – hodowla komórkowa
Szklane pokrywki o średnicy 12 mm	NeuVitro	1001/12	Wsparcie hodowli komórkowych w zastosowaniach immunofluorescencjach, zastosowanie - wsparcie dla komórek
Kleszcze	Sigma-Aldrich	81381	Tanie i solidne medium montażowe, które dobrze sprawdza się w większości fluoroforów, zastosowanie - montaż