Obrazowanie fluorescencyjne kolonizacji bakteryjnej w tkance nerek myszy

Streszczenie

Źródło: Behera, R. K. i in. Metoda oparta na fluorescencji do badania regulacji genów bakteryjnych w tkankach zakażonych. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje metodę przygotowania zakażonej tkanki nerki myszy, barwienia DNA oraz wykrywania ekspresji genów bakterii za pomocą dwóch fluorescencyjnych reporterów. Czerwony oznacza wszystkie bakterie, a zielony podkreśla komórki reagujące na infekcje.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. etyki zwierząt.

1. Pobieranie organów i przetwarzanie tkanek
   1. Uśpieć zwierzęta poprzez wdychanie_CO2 i zwichnięcie szyjki jako metodę wtórną, a następnie wykonać nekropsję.
   2. Pobierz nerkę (po prawej) oraz inne ważne narządy (serce, wątrobę, płuca, śledzionę) i przenieś do 15 mL probarek polipropylenowych zawierających 10% buforowanej formaliny [v/v].
   3. Pozwól organom ustabilizować się w ciemności w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając lub obracając przez co najmniej 24 godziny, ale nie dłużej niż 48 godzin.
   4. Osadz narządy w przezroczystym nośniku do zamrażania tkanek i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
   5. Za pomocą kriostatu pokroj tkankę na kawałki o grubości 10 μm.
   6. Susz fragmenty na wcześniej wyczyszczonym, naładowanym szklanym szkiecie przez 20 minut w ciemności. Nałóż twardy materiał montażowy z barwcą 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) oraz pokrywką pokrywową. Zamki zamontowane przez noc w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej i przeniesione do 4 °C do długotrwałego przechowywania.
2. Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna i przetwarzanie obrazów
   1. Zbadaj zamontowane preparaty, aby zlokalizować zmiany za pomocą laserów odpowiednich dla używanego fluorescencyjnego reportera. W tym przypadku stosuje się sygnały fluorescencyjne zielonego (GFP, czyli zielone białko fluorescencyjne), czerwonego (tdTomato) i niebieskiego (DAPI).
   2. Uzyskuj obraz za pomocą odpowiedniego obiektywu do wizualizacji pojedynczych komórek (np. zazwyczaj używa się obiektywów 20x lub 40x).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57Bl/6	Rzeka Charles	NA
Konfokalny mikroskop laserowy skanujący	Zeiss	NA
Mikrotom kriostatu	Thermo Scientific	NA
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Homogenizator Precellys 24	Laboratoria Bertin	NA
Sub Xero przezroczyste medium do zamrażania tkanek	Mercedes Medical	MER5000
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Antifade Medium z DAPI	Laboratoria Vector	H-1500