Obrazowanie zmian morfologicznych u bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Streszczenie

Źródło: Brzozowski, R. S. i in. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu badania lokalizacji białek podkomórkowych oraz zmian morfologii komórek u bakterii. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek, aby wizualizować zmiany morfologiczne bakterii w czasie rzeczywistym. Opisuje etapy związane z obrazowaniem, akwizycją poklatkową oraz dekonwolucją w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

Protokół

1. Obrazowanie

1. W dniu eksperymentu włącz system mikroskopu. Uruchom oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów), klikając odpowiednią ikonę na pulpicie. Zainicjalizuj mikroskop, klikając opcję Inicjalizuj mikroskop (przycisk oznaczony mikroskopem) w oknie dialogowym uruchamiającym oprogramowanie. Upewnij się, że obiektyw jest całkowicie opuszczony za pomocą grubej korekty mikroskopu przed inicjalizacją.
   UWAGA: Po inicjalizacji powinny pojawić się trzy dodatkowe okna dialogowe oprócz menu start: resolve3D, zbieranie danych oraz monitor filtrów.
2. Na obiektyw immersyjny 100x dostarczany przez producenta umieścić kroplę oleju o wartości 1,517 (współczynnik załamania) (apertura numeryczna = 1,4, odległość pracy = 0,12 mm; patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Ważne jest, aby wybrać odpowiedni olej immersyjny do temperatury, w której wykonywane jest obrazowanie.
3. Załaduj szklaną spodną miskę z próbką do metalowej obudowy (trumny) i delikatnie włóż ją do zacisku sceny.
4. Użyj grubego pokrętła regulacji, aby podnieść obiektyw, aż olej dotknie szklanego dna naczynia. Użyj okularu i pokrętła do precyzyjnej regulacji, aby wyostrzyć próbkę. Gdy komórki są ostre, przekręć pokrętło z trybu okularu na aparat, przesuwając przełącznik selektora umieszczony z przodu korpusu mikroskopu w lewo.
5. Rozpocznij eksperyment za pomocą oprogramowania do obrazowania. W oknie resolve3D wybierz ikonę Projektuj/przeprowadzić eksperyment przedstawioną przez kolbę. Powinno pojawić się nowe okno dialogowe zatytułowane design/run experiment.
   1. Ustaw liczbę stosów Z i grubość próbki za pomocą zakładki projektowania , a następnie przekrojów w oknie dialogowym projektu/przeprowadz eksperyment .
      UWAGA: Do eksperymentów w sekcji reprezentatywnych wyników użyto 17 stosów Z na odstępie 200 nm dla zdjęć nieruchomych oraz cztery stosy Z na odstępie 200 nm dla mikroskopii poklatkowej czasopowolniowej.
   2. Aby zmierzyć grubość komórek w próbce, ręcznie dostosuj płaszczyznę Z, używając strzałek w górę i w dół w oknie dialogowym resolve3D . Zaznacz miejsca, gdzie komórki tracą ostrość, jako górne i dolne granice akwizycji obrazu. Zaimportuj te informacje przed rozpoczęciem eksperymentu.
   3. Aby zminimalizować fototoksyczność i wybielanie podczas obrazowania poklatkowego, należy zmniejszyć liczbę stosów Z i wybrać płaszczyznę środkową komórek do akwizycji obrazu.
6. Wybierz odpowiedni zestaw filtrów dla eksperymentu, używając zakładki projekt, a następnie kanały w oknie dialogowym projekt/uruchom eksperyment (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Wybierz także źródło do zbioru informacji o POL/DIC. Dostosuj procentową transmisję (intensywność światła) oraz czas ekspozycji dla poszczególnych kanałów wybranych przed rozpoczęciem obrazowania, wybierając odpowiednie opcje w oknie dialogowym resolve3D .
      UWAGA: W polu widzenia testowym, które nie jest brane pod uwagę w eksperymencie, przetestuj te ustawienia, aby sprawdzić, czy wybrane parametry uzyskują istotne dane fluorescencyjne bez pomijania słabego sygnału lub jego nadmiernego nasycenia. Następnie zaimportuj te parametry do konfiguracji eksperymentalnej.
7. Otwórz listę punktów, wybierając przycisk Lista punktów w oknie dialogowym resolve3D . Powinno pojawić się nowe okno dialogowe z tytułem lista punktów. Zaznacz kilka pól widzenia do wykorzystania w eksperymencie, znajdując odpowiednie pola widzenia za pomocą kontrolek etapu mikroskopu i wybierając opcję zaznaczenia punktu w oknie dialogowym listy punktów.
   UWAGA: Punkt wymiany będzie musiał być wybierany za każdym razem, gdy mikroskop zostanie ponownie skupiony na punkcie z listy punktów. Można to zrobić, skupiając mikroskop na odpowiednim punkcie na liście, a następnie wybierając przycisk zamień punkt . Ważne jest, aby nie dotykać analogowego pokrętła regulacji grubości/drobności podczas ponownego ustawiania ostrości; Używaj tylko oprogramowania do regulacji ostrości.
8. Ustaw parametry time-lapse, najpierw wybierając zakładkę projekt, a następnie time-lapse w oknie dialogowym projekt/uruchom eksperyment. Zaznacz pole zaznaczenia timelapse. Wprowadź odpowiednie parametry time-lapse w liczbie obrazów time-lapse na całkowity czas.
9. Ustaw punkty do wyświetlenia z listy punktów, najpierw wybierając zakładkę projekt, a następnie punkty w oknie dialogowym projekt/przeprowadzić eksperyment. Wybierz opcję listy punktów wizyty i wprowadź punkty do zdjęcia w polu tekstowym, oddzielone przecinkami lub łącznikami, jeśli jest to kompletna sekwencja.
10. Przed rozpoczęciem eksperymentu edytuj nazwy plików i lokalizacje plików, korzystając z zakładki run w oknie dialogowym projekt/uruchom. Lokalizację pliku można zmienić, wybierając przycisk ustawień , wybierając folder danych, a następnie wybierając odpowiedni folder lub tworząc nowy. Zmień nazwy plików, wpisując nową nazwę pliku w polu tekstowym z nazwą pliku obrazu.
11. Rozpocznij eksperyment, wybierając przycisk odtwarzania w oknie dialogowym "rozpocznij eksperyment ".
    UWAGA: Dla time-lapse stale sprawdzaj ostrość w każdym polu widzenia przez cały eksperyment, używając ustawienia DIC (aby uniknąć niepotrzebnego fotobielenia) oraz ponownie ostrość i aktualizuj informacje z listy punktów, ponieważ komórki z czasem tracą ostrość.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	BioReagenty Fishera	BP160-100	Stopień z biologii molekularnej – Niski EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Mikroskopia
Szklana miska na dnie	MatTek	P35G-1.5-14-C	Mikroskopia
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Spersonalizowany stojak mikroskopu Olympus IX-71; Niestandardowa wieża oświetleniowa oraz moduł oświetlenia transmisyjnego. Cele: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLEJ OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prism Nomarski do 100x celu; aparat CoolSnap HQ2; SSI Assembly 7-kolorowy; Komora kontroli środowiska – nieprzezroczysta.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	Inhibitor FtsZ
SoftWorx	GE		Oprogramowanie obrazujące dostarczone przez producenta