$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Szczepienie Listeria monocytogenes u myszy za pomocą zastrzyku do żyły ogonowej oraz ocena obciążenia bakteryjnego wątrobą, śledzioną i sercem
UWAGA: Cała praca na zwierzętach odbywa się zgodnie z wytycznymi CDC Biosafety Level 2. Myszy są zazwyczaj zamawiane tydzień wcześniej i trzymane w klatce razem z 5 zwierzętami w każdej klatce. Myszy mogą się przyzwyczaić do nowego środowiska laboratoryjnego przez cztery dni przed podaniu iniekcji. W tych eksperymentach wykorzystano 6-8 tygodniowe samice myszy Swiss-Webster, które trzymano 5 osob w klatce w środowisku barierowym i karmione dietą bez ograniczeń.
- Przygotuj po jednej klatce z myszami na raz, zdejmując pokrywę i pojemniki na jedzenie i wodę, a klatkę podkładaj pod lampę grzewczą na pięć minut. Proces ten pozwala na rozszerzenie żył ogonowych, co ułatwia wykonywanie zastrzyków.
- Usuń jedno zwierzę i umieść je w uprzęży (lub rurce falcon z odciętym końcem), aby unieruchomić zwierzę podczas zastrzyku.
- Oczyść miejsce wstrzyknięcia za pomocą podkładki alkoholowej i pozwól alkoholowi odparować. To nie tylko oczyszcza miejsce, ale także dodatkowo rozszerza żyłę ogonową.
- Używając strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o grubości 27,5, delikatnie wstrzyknij myszy 200 μl pożądanej hodowli do żyły ogonowej.
- Użyj gazy, aby zatrzymać krwawienie, które może wystąpić w wyniku zastrzyku, i umieść zwierzę w nowej klatce.
- Powtórz ten proces dla pozostałych zwierząt i szczepów. Pamiętaj, aby każda klatka zwierząt była oznaczona szczepem, który otrzymała.
- Codziennie sprawdzam zwierzęta, usuwając i składając ofiary z tych, które wydają się chore. Jeśli żadne zwierzę nie wykazuje oznak choroby, pozwól infekcjom trwać przez 72 godziny, zanim poświęcisz wszystkie zwierzęta.
- Aby poświęcić się, należy użyć znieczuleniaCO2 z butelkowanego źródła aż do zatrzymania wszystkich oddechów, a następnie użyć zwichnięcia szyjki macicy, aby upewnić się, że zwierzę nie żyje.
- Po złożeniu ofiary przenieś zwierzęta do kaptury do hodowli tkankowej na sekcję.
- Używając bloku do sekcji, przypiń każdą nogę zwierzęcia grubymi igłami i spryskuj 70% etanolem, aż zostanie nasycone.
- Przetnij skórę brzucha i tułowia za pomocą nacięcia w kształcie litery Y, które rozciąga się od otworu pochwy do wyrostka ksifoidalnego, a następnie przechodzi aż do pachy każdego ramienia.
- Odciągnij skórę i usuń igły z każdej nogi, aby utrzymać rozwarstwienie otwarte.
- Przetnij delikatnie otrzewną, odsłaniając jelita, żołądek, wątrobę i śledzionę.
- Najpierw przecinając żyłę wątrobową i więzadło koronne na górze wątroby, zacznij usuwać wątrobę. Dodatkowe więzadła do usunięcia znajdują się pod wątrobą, łącząc ją z pierwszą częścią jelita cienkiego oraz z mięśniami pleców.
- Umieść wątrobę w 5 ml sterylnej ddH20 w 50 ml sondy falcon.
- Następnie usuń śledzionę, izolując ją i delikatnie odcinając naczynia oraz więzadła. Śledziona będzie usuwana łatwiej niż wątroba. Umieść śledzionę w osobnej sonii z 5 ml sterylnej ddH200.
- Zlokalizuj przeponę i delikatnie przetnij wzdłuż klatki piersiowej, aby zobaczyć klatkę piersiową. Przeciąć wyrostek keksfoidalny i mostek do poziomu szyi, aby otworzyć klatkę piersiową, odsłaniając serce i płuca.
- Za pomocą kleszczy delikatnie chwyć serce za wierzchołek i unieś je tak, aby aorta i naczynia płucne były napięte. Przetnij te naczynia, aby uwolnić serce.
- Umieść serce w 50 ml sondy falcon zawierającej 5 ml sterylnego ddH200.
- Usuń tusę myszy i powtórz ten proces dla każdego zwierzęcia, używając czystych rurek sokoła zawierających 5 ml sterylnego ddH20 dla każdego usuniętego organu.
- Po usunięciu wszystkich organów oczyść stanowisko i wrócić na stanowisko.
- Przygotuj zestaw 5 probówek do czyszczenia i sterylizacji homogenizatora dla każdego zestawu narządów z pięciu myszy (np. jeden zestaw 5 rurek na 5 wątrob, 5 rurek na 5 śledziony i 5 rurek na 5 serc). Cztery z każdej probówki powinny być wypełnione 30 ml sterylnym ddH200, a jedna 30 ml 90% EtOH.
- Za pomocą TissueMaster (lub równoważnego homogenizatora) zanurz homogenizator (podczas pracy) w probówkach przygotowanych w kroku 1.21 w następujący sposób, aby oczyścić sondę:
- Lampa 1 (ddH2O) 5 sekund w lampie 2 (ddH2O) 5 sekund w lampie 3 (EtOH) 5 sekund w lampie 4 (ddH2O) 5 sekund w lampie 5 (ddH2O)
- Ujednolicz jedną wątrobę za pomocą homogenizatora przez co najmniej 2 minuty, czyli aż nie pozostaną widoczne fragmenty narządu. Użyj pęsety, aby usunąć duże zanieczyszczenia z sondy.
- Powtórz opisany proces czyszczenia.
- Powtórz proces homogenizacji dla pozostałych wątrob, upewniając się, że sonda jest przemyta między wątrobami według opisanego procesu.
- Gdy wszystkie wątroby są całkowicie ujednolicone, wyrzuć rurki do płukania (1-5) dla wątroby.
- Powtórz proces homogenizacji/czyszczenia zarówno śledziony, jak i serca, upewniając się, że używasz nowego zestawu rurek do płukania dla każdej serii organów. Jeśli w którymkolwiek momencie rurki do płukania stają się mętne, wyrzuć je i zastąp na nowe, aby zakończyć serię.
- Po ujednoliceniu wszystkich organów wykonaj ostatni cykl czyszczenia homogenizatora i dobrze go wysusz do przechowywania.
- Umieść około 200 μl każdego organu w osobnym dołku z płytą 96-dołową.
- Wykonuj serialne rozcieńczenia próbek narządów poprzez rozcieńczanie 1:10 w serii do rozcieńczenia 1:10 000 (wątroba i śledziona) lub do rozcieńczenia 1:1 000 (serce).
- Umieść serię rozcieńczania punktowo na wcześniej podgrzanym agarze LB. Usuń także 20 ul każdego nierozcieńczonego narządu i płytki na osobne płytki agaru LB, aby wyliczyć CFU z słabo skolonizowanych narządów.
- Usuń rurki sokoła zawierające ujednolicone organy, owiń 96-dołkowe płytki zawierające serię rozcieńczeń parafilmem i umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
- Pozwól plamom wyschnąć. Proces ten przyspiesza się przez umieszczenie talerzy w osłonie i zdjęcie pokrywek.
- Po wyschnięciu plam umieść płytki na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Następnego ranka policz liczbę kolonii w każdym miejscu i użyj serii rozcieńczeń do obliczenia całkowitej liczby bakterii na narząd.