$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. etyki zwierząt.
1. Infekcja
- Pobierz myszy BALB/c obu płci w wieku od 10 do 12 tygodni życia.
UWAGA: Szczep serotypu 4 Streptococcus pneumoniae TIGR4 to zjadliwy izolat kliniczny, który został zsekwencjonowany. - Uprawiaj TIGR4 w bulionie Todd-Hewitt w temperaturze 37 °C w 5%CO2, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) 620 wynoszącą 0,5 (odpowiadającą 1,0 x 10 8 jednostek kolonii [CFU]/ml). Rozpyl hodowlę pneumokokową przez wirowanie przez 10 minut przy 3 500 x g i usuń supernatant za pomocą linii próżniowej. Zawiesz i rozcieńcz bakterie sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) do końcowego stężenia 1,0 x 104 CFU/ml.
- Za pomocą komory indukcyjnej znieczulaj myszy z 2,5% odparowanym izofluranem w tlenie. Potwierdź stan znieczuloności delikatnym uszczypnięciem palca tępą pęsetą.
- Trzymając znieczuloną mysz za kark i stojąc jedną ręką, wstrzykuj każdej myszy dootrzewnowkowo (i.p.) 100 μl zawiesiny S. pneumoniae za pomocą strzykawki z igłą 27-30 gauge (odpowiadającą dawce wyzwania 1,0 x 103 CFU). Umieść mysz z powrotem w klatce. Myszy zazwyczaj budzą się 30-40 sekund po wstrzyknięciu.
- Pozwól, by infekcja trwała co najmniej 24 (wcześnie) lub 30 (zaawansowany) godzin.
- Uśpij myszy przez uduszenieCO2 . Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby upewnić się, że mysz nie żyje. Eutanazja jest dodatkowo potwierdzana przez usunięcie serca w kroku 1.6.
- Dezynfekuj ogon opaską z alkoholem i odetnij kawałek o grubości 2-3 mm. Pobierz 2 μl krwi i rozcieńcz ją szerejnie 10 razy w PBS zawierającym heparynę sodową 1 U/ml pięć razy. Rozcieńczanie seryjne na tryptycznej płycie sojowej krwi i inkubacja przez noc w temperaturze 37 °C w 5%CO2. Następnego dnia ekstrapolacja z kolonii liczy poziom bakteriemii.
- Unieruchom mysz w pozycji leżącej na platformie chirurgicznej. Spryskaj klatkę 70% etanolem i wytłuknij ją na sucho. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz jamę klatki piersiowej, usuń klatkę piersiową i przeciąż przeponę, odsłaniając serce i płuca. Nożyczkami przetnij naczynia krwionośne połączone z sercem i delikatnie usuń serce, aby zapobiec powstaniu siniaków za pomocą kleszczy.
- Przepłukaj serce PBS, a następnie umieść je w kasetach do pobierania próbek tkankowych, aby podczas cięcia tkanek uzyskano przecięcia koronowe. Do osadzania parafiny umieść kasety w 10% roztworze buforowanej formaliny, a następnego dnia wyślij do osadzenia parafiny.
- Alternatywnie, szybkie zamrażanie przy użyciu związku o wysokiej temperaturze cięcia (O.C.T.) w kryomoldzie, który został umieszczony na suchym lodzie.
2. Wizualizacja zmian sercowych i pneumokoków w obrębie zmian
- Przytnij fragmenty serca osadzone w parafinę tak, aby w każdej tkance widoczne były 4 komory serca. Cięcie szkiełów o grubości 5 μm.
- Deparaffinizuj i barwi szkiełki hematoksyliną i eozyną (H&E) standardowymi metodami.
- Oglądaj przecięcia serca barwione H&E za pomocą mikroskopu świetlnego przy niskich (100X, 200X) i wysokich (zanurzenie w oleju: 400X, 1000X) powiększeniach. Charakteryzować serca pod kątem obecności mikrozmian w mięśniu sercowym. Tutaj wykonaj zdjęcia H&E za pomocą mikroskopu Zeiss Axioskop 2 wyposażonego w obiektyw 100x 1.3 apertury liczebnej Plan-NEOFLUAR.
UWAGA: Na wczesnych etapach zmiany serca są rozróżniane przez różny kolor, a w niektórych przypadkach także obecność komórek odpornościowych (monocytów i granulocytów), które wyglądają na monocyty. W zaawansowanych zmianach, szczególnie tych widocznych po 30 godzinach, brakuje komórek odpornościowych, a w ich miejsce obserwuje się duże, wakuolowe zmiany. Ważne jest, aby zauważyć, że choć napływ komórek odpornościowych we wczesnych stadiach rozwoju zmian serca może wystąpić, nie wydaje się to być koniecznością.