$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. etyki zwierząt.
1. Infekcja
- Zdobądź myszy BALB/c obu płci w wieku od 10 do 12 tygodni.
UWAGA: Szczep serotyp 4 Streptococcus pneumoniae TIGR4 to zjadliwy izolat kliniczny, który został zsekwencjonowany. - Uprawiaj TIGR4 w bulionie Todd-Hewitt w temperaturze 37 °C w 5% CO2, aż hodowla osiągnie gęstość optyczną 620 nm (OD620) wynoszącą 0,5 (odpowiadającą 1,0 × 10 8 jednostek kolonii [CFU]/ml). Rozpyl hodowlę pneumokokową przez 10 minut w stężeniu 3 500 × g i usuń supernatant za pomocą linii próżniowej. Zawiesz i rozcieńcz bakterie za pomocą jałowej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do końcowego stężenia 1,0 ×10,4 CFU/ml.
- Za pomocą komory indukcyjnej znieczulaj myszy z 2,5% odparowanym izofluranem w tlenie. Potwierdź stan znieczuloności delikatnym uszczypnięciem palca tępą pęsetą.
- Trzymając znieczuloną mysz za kark i stojąc jedną ręką, wstrzykuj każdej myszy dootrzewną (i.p.) 100 μl zawiesiny S. pneumoniae za pomocą strzykawki z igłą 27-30 gauge (odpowiadającą dawce wyzwania 1,0 × 103 CFU). Umieść mysz z powrotem w klatce. Myszy zazwyczaj budzą się 30-40 sekund po wstrzyknięciu.
- Pozwól, by infekcja trwała co najmniej 24 (wcześnie) lub 30 (zaawansowany) godzin.
- Uśpij myszy przez uduszenie CO2. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby upewnić się, że mysz nie żyje. Eutanazja jest dodatkowo potwierdzana przez usunięcie serca w kroku 1.6.
- Dezynfekuj ogon opaską z alkoholem i odetnij kawałek o grubości 2-3 mm. Pobierz 2 μl krwi i rozcieńcz ją szerejnie 10 razy w PBS zawierającym heparynę sodową 1 U/ml pięć razy. Rozcieńczanie seryjne na płytce tryptycznej sojowej i inkubacja przez noc w temperaturze 37 °C w stężeniu 5% CO2. Następnego dnia ekstrapolacja z kolonii liczy poziom bakteriemii.
- Unieruchom mysz w pozycji leżącej na platformie chirurgicznej. Spryskaj klatkę 70% etanolem i wytłuknij ją na sucho. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz jamę klatki piersiowej, usuń klatkę piersiową i przeciąż przeponę, odsłaniając serce i płuca. Nożyczkami przetnij naczynia krwionośne połączone z sercem i delikatnie usuń serce, aby zapobiec powstaniu siniaków za pomocą kleszczy.
- Przepłukaj serce PBS, a następnie umieść je w kasetach do pobierania próbek tkankowych, aby podczas cięcia tkanek uzyskano przecięcia koronowe. Do osadzania parafiny umieść kasety w 10% roztworze buforowanej formaliny, a następnego dnia wyślij do osadzenia parafiny.
- Alternatywnie zamrożenie błyskawiczne przy użyciu optymalnej temperatury cięcia (O.C.T.) Związek w kryomoldzie, który został umieszczony na suchym lodzie.
2. Wizualizacja zmian sercowych i pneumokoków w obrębie zmian
- Przytnij fragmenty serca osadzone w parafinę tak, aby w każdej tkance widoczne były 4 komory serca. Cięcie szkiełów o grubości 5 μm.
- Deparaffinizuj i barwi szkiełki hematoksyliną i eozyną (H&E) standardowymi metodami.
- Oglądaj przekroje serca zabarwione H&E za pomocą mikroskopu świetlnego przy niskich (100×, 200×) i wysokich (zanurzenie olejowe: 400×, 1000×) powiększeniach. Charakteryzować serca pod kątem obecności mikrozmian w mięśniu sercowym. Tutaj wykonaj zdjęcia H&E za pomocą mikroskopu Zeiss Axioskop 2 wyposażonego w obiektyw 100× 1,3 apertury numerycznej Plan-NEOFLUAR.
UWAGA: Na wczesnych etapach zmiany serca są rozróżniane przez różny kolor, a w niektórych przypadkach także przez obecność komórek odpornościowych (monocytów i granulocytów), które wyglądają na monocyty. W zaawansowanych zmianach, szczególnie tych widocznych po 30 godzinach, brakuje komórek odpornościowych, a w ich miejsce obserwuje się duże, wakuolowe zmiany. Ważne jest, aby zauważyć, że choć napływ komórek odpornościowych we wczesnych stadiach rozwoju zmian serca może wystąpić, nie wydaje się to być koniecznością.
3. Mikroskopia immunofluorescencyjna pneumokoków w mikrozmianach
- Krojów serce w krioformach mikrotomem o grubości 5 μm i umieszcza je na dodatnio naładowanych szkiełkach szklanych. Pozwól zamrożonym przekrojom serca rozmrozić się i wyschnąć na powietrzu. Umocuj sekcje przez 10 minut w 10% neutralnej formalinie buforowanej (pH 6,8-7,2 w 25 °C).
- Wash slide (3×) w PBS przez 5 minut, permeabilizuje się przez 15 minut w 0,2% Triton X-100 w PBS, a następnie ponownie w PBS.
- Blokuj przekrój tkanki na preparatach z 10% surowicy koziej w PBS przez 1 godzinę.
- Płukaj preparaty PBS, przykryj i inkubuj cięcia serca z antyserotypowym pneumokokom z królika w stężeniu 1:1 000 w PBS z 10% surowicą kozą przez 2 godziny w 37 °C.
UWAGA: W przypadku negatywnej kontroli badacze powinni stosować naiwne królicze środki przeciwserum - Po umyciu PBS przykryj i inkubuj sekcje z 10% surowicy-PBS koziego przeciwciałem przeciwko króliczym fluoresceinowym izotiocyanianowi (FITC) w proporcji 1:2 000 przez 30 minut w 37 °C.
- Zgodnie z zaleceniami producenta, należy stosować DAPI (4',6- Diamidino-2-fenylindol) w dawce 5 mg/ml do wizualizacji jąder eukariotycznych. Myj i mocuj fragmenty tkanek FluorSave.
- Uzyskuj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu konfokalnego zarówno przy niskim, jak i wysokim powiększeniu. Dostosuj odpowiednią aperturę numeryczną, aby uzyskać optymalne rezultaty. Tutaj wykonuj zdjęcia fluorescencyjne za pomocą systemu konfokalnego z obiektywem o aperturze numerycznej 60× 1,42.