Wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność na podstawie wzbogaconych próbek much na PCR

Streszczenie

Źródło: Pava-Ripoll i in. Wykrywanie patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność u pojedynczych much. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje metodę opartą na PCR, która wzmacnia docelowe DNA bakterii z wzbogaconych próbek much za pomocą tabletek specyficznych dla patogenów, umożliwiając wykrywanie fluorescencji w czasie rzeczywistym i analizę krzywej topnienia w celu potwierdzenia obecności patogenów przenoszonych przez żywność u poszczególnych owadów.

Protokół

1. Hydratowane tabletki PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) – gotowe tabletki

1. Wybierz chłodzony (4 °C) blok chłodzący PCR i umieść nad wkładką stojak na rurki PCR.
2. Zgodnie z plikiem w regale, umieść odpowiednie rurki PCR zawierające tabletki gotowe do PCR (dołączone do każdego zestawu) dla docelowego patogenu przenoszonego przez żywność.
3. Używając narzędzia do odkapowywania, ostrożnie wyjmij kapsułki z rurek PCR. Usuń kapsle i sprawdź, czy każda probówka zawiera tabletkę.
4. Przenieś 50 μl (na Salmonella i Cronobacter) lub 30 μl (na L. monocytogenes) lizatu do konkretnych probówek PCR. Użyj nowych nakręceń optycznych i mocno je przymocuj do rurek PCR za pomocą narzędzia do zakrętowania.
   UWAGA: Po dodaniu lizatu do tabletek gotowych do PCR, próbki muszą pozostać schładzone w temperaturze 2–8 °C do momentu załadowania do systemu detekcji opartego na PCR. Rurki PCR można wirować w 2 500 x g przez kilka sekund, aby upewnić się, że pełna objętość znajduje się na dnie probówki.
5. Załaduj lampy PCR do cyklera/systemu detekcyjnego PCR, otwierając szufladę instrumentów.
6. Włóż stojak z rurkami PCR do wnęlek w szufladzie i sprawdź, czy rurki są prawidłowo osadzone.
7. Zamknij szufladę i uruchom program zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Instrument oparty na PCR ma z góry ustalone parametry cykliczne dla każdego patogenu przenoszonego przez żywność.
8. Sprawdź, czy pasek statusu cyklu PCR pokazuje niebieski pasek wskazujący, że część wzmacniająca programu jest uruchomiona.
   UWAGA: W przypadku standardowych testów PCR czas przetwarzania całego programu (amplifikacja i detekcja) trwa około 3–3,5 godziny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzie do zakręcania	DuPont	D11677028
Narzędzie do dekapowania	DuPont	D11134095
Stojaki/uchwyty na lampy PCR	DuPont	D12701663
Cienki czubek, proste szczypce	BioQuip	4731	Sterylizuj przed użyciem. Wielu dostawców.
Blok chłodzący			Wielu dostawców.
Wirówka			Wielu dostawców.