Szybki test obrazowy do wykrywania zjadliwości bakteryjnej indukowanej powierzchnią

Streszczenie

Źródło: Perinbam, K., i Siryaporn, A. Szybki test wirulencji bakteryjnej oparty na obrazach z użyciem ameby. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje szybką, opartą na obrazach metodę oceny zjadliwości bakterii poprzez inkubację ameb z bakteriami przytwierdzonymi do powierzchni lub planktonicznymi, zastosowanie podkładki kalcein-acetoxymetyloesterowej (kalcein-AM) agarozy oraz obrazowanie fluorescencji w celu wykrycia uszkodzeń komórek gospodarza.

Protokół

1. Mikroskopia – przygotowanie podkładki agarowej

1. Przygotuj podkładki agarowe na około 30 minut do 1 godziny przed tym, jak ameby będą gotowe do wymieszania z Pseudomonas aeruginosa.
2. Podgrzej w mikrofali 50 mL agaru 1% (w/v) w buforze wywoływaczym (DB) w kolbie 250 mL. Mieszaj co 20 sekund, aż grudki agaru znikną.
3. Schłodzić stopiony agar, umieszczając go w rozgrzanej kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C na 15 minut.
4. Dodaj 15 μL roztworu kalcein-AM do 15 ml stopionego agaru w stożkowej tubie. Mieszaj, delikatnie odwracając rurkę 4-5 razy, i od razu przejdź do kolejnego kroku.
   UWAGA: Ten krok wykonaj w probówce wirówki polipropylenowej o pojemności 15 mL. Nie używaj grubego szklanego pojemnika, ponieważ spowoduje to zbyt szybkie zastyganie agaru.
5. Wylej roztopioną mieszankę agaru na szklaną płytkę o wymiarach 12 cm x 10 cm i pozwól agarowi zastygnąć przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pokrój stwardniały tączk agarowy na mniejsze sekcje o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm, umieszczając szklaną płytkę na nadrukowanej siatce i tnąc wzdłuż siatki metalową linijką.
6. Utrzymuj żel nawilżony w wilgotnym pudełku, aż będzie gotowy do użycia.

2. Mikroskopia – przygotowanie próbki bakterii-ameby do obrazowania

1. Aby ocenić zjadliwość komórek bakteryjnych przyczepionych do powierzchni, należy dodać 10 μL komórek ameby do bakterii przyczepionych do powierzchni.
   UWAGA: Ten etap opisuje mieszanie ameb z bakteriami.
2. Aby ocenić zjadliwość komórek planktonowych, wymieszaj 10 μL komórek amebowych z 10 μL bakterii planktonowych.
   UWAGA: Nie myj komórek ameby wyhodowanych aksenicznie (przy przedawkowaniu₆₀₀ od 0,2 do 0,5) przed wymieszaniem z bakteriami. Nie zaobserwuje się wzrostu E. coli w hodowli ameba dzięki zastosowaniu antymikotycznego roztworu antymikotycznego.
3. Natychmiast umieść podkładkę agarową o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm z kroku 1,5 na mieszance bakterii i ameb na powierzchni szalki Petriego.
   UWAGA: Umieść podkładkę agarową na masie szybkim, płynnym ruchem. Nie opuszczaj podkładki powoli na mieszankę, ponieważ ten ruch ma tendencję do wypychania komórek w stronę obwodu i z dala od spodu podkładki. Ten etap zapewni, że bakterie i ameby są równomiernie wymieszane, unieruchomione, unieruchomione oraz że oba typy komórek będą ograniczone do tej samej płaszczyzny.
4. Usuń nadmiar płynu, delikatnie pipiturując resztki otaczające podkładkę agarową. Pozwól szalce Petriego wyschnąć przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przykryj szalkę Petriego pokrywką i inkubuj unieruchomioną mieszankę ameby i bakterii w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 40 minut. Przejdź do kroku 3.1.
   UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie próbki inkubować przez ten sam czas, ponieważ fluorescencja tła wzrasta z czasem. Zaleca się czas inkubacji 1 godziny. Inkubacje trwające dłużej niż 1 godzinę są mniej powtarzalne, ponieważ komórki ameb mogą zacząć pękać.

3. Mikroskopia – akwizycja obrazów

1. Obrazuj ameby za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do rejestrowania obrazów w świetle i zielonej fluorescencji. Dla zielonej fluorescencji stosuje się filtry białka zielonej fluorescencji (GFP) o 474/27 nm i 525/45 nm odpowiednio do wzbudzania i emisji. Użyj obiektywu 10X (apertura numeryczna ≥0,3) do obrazowania ameb.
   UWAGA: Kalceina-AM w agarze spowoduje fluorescencję umierających ameb w zielonym kanale fluorescencji. Zdrowe ameby poza tym nie są fluorescencyjne.
2. Dostosuj czasy akwizycji dla kontrastu fazowego, kanałów GFP, aby ograniczyć fototoksyczność i zoptymalizować zakres dynamiczny natężeń obrazu. W razie potrzeby zastosuj kontrast fazowy różnicowego interferencyjnego kontrastu (DIC).
   UWAGA: Używaj ekspozycji 100–200 ms do kontrastu fazowego i fluorescencji GFP, jeśli to możliwe. Zachowaj niezmienione ustawienia ekspozycji i instrumentów przez cały eksperyment. Jest to kluczowe dla obliczenia indeksu zabijania hosta.
3. Pobierz zdjęcia co najmniej 100 komórek ameby, aby uzyskać dobre statystyki do obliczenia wskaźnika zabijania gospodarza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Bacto agar, odwodniony	BD Difco	214010
Antybiotyk przeciwmykotyczny (100X)	Technologie życia	15240062	Aliquot < 1 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C
Ester kalcein-acetoksymetyloowy (kalcein-AM)	Technologie życia	C34852	Kalceina Acetoksymetylo-(AM)
Chlorek wapnia, bezwodny	Sigma-Aldrich	C1016
D-glukoza	Fisher Chemical	D16500	Dekstroza
Dimetylsulfoksyd	Sigma-Aldrich	D5879
Kwas foliowy	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Ekstrakt drożdżowy	Oksoid	LP0021
Specjalny pepton	Oksoid	LP0072
Hydroksyk potasu	Fisher Chemical	P250
Fosforan potasu monozasadowy	Sigma-Aldrich	P0662
Heptahydrat fosforanu sodu	Fisher Chemical	S373
Witamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Szczepy
Dictyostelium discoideum	Laboratorium Siryaporn	Szczep AX318
Escherichia coli	Laboratorium Siryaporn	Szczep B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Laboratorium Siryaporn	PA14	Strain19 PA14
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Laboratorium Siryaporn	AFS20.1	Szczep pochodzący od PA1420
Zaopatrzenie
Filtr 0,22 μm	Millipore	SCGPT01RE	Do sterylizacji filtrów
Lampa stożkowa, 15 mL	Corning	352097
Szklane butelki do przechowywania	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Szalka Petriego, średnica 6 cm	Corning	351007	Płyty polistyrenowe 60 x 15 mm
Szalka Petriego, średnica 10 cm	Fisher	FB0875712	Płyty polistyrenowe 100 x 15 mm
Plastikowe pojemniki z pokrywką	Ziploc	2.57E+09	Kwadratowe pojemniki na 3 filiżanki
Szklane płyty	Bio-Rad	1653308	Do przygotowania podkładów agarowych. Inne szklane płyty mogą być używane o podobnych wymiarach.
Drewniane patyki	Fisher	23-400-102
Wyposażenie
Mikroskop Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Układ mikroskopu
10X Plan Fluor Ph1 obiektyw 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Układ mikroskopu
Źródło wzbudzenia fluorescencji	Lumencor	Lekki silnik Sola	Układ mikroskopu
Zestaw filtrów fluorescencyjnych	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Układ mikroskopu
Aparat Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Układ mikroskopu
ImageJ	NIH	w. 1.49	Oprogramowanie do analizy obrazów
MATLAB	Mathworks	R2013	Oprogramowanie do analizy obrazów
Inkubator orbitalny	VWR	89032-092	Do wzrostu bakterii w temperaturze 37 °C
Stabilizator platformowy	Fisher	13-687-700	Do wzrostu ameb w temperaturze 22 °C
Spektrofotometr	Biochrom	Ultrospec 10
Chłodzony inkubator pod ladą	Fisher	97990E	Do wzrostu ameb w temperaturze 22 °C
Kąpiel wodana isotemp	Fisher	15-462-21Q	Dla chłodzenia do 55 °C