Ocena obciążenia bakteryjnym śledziony myszy w badaniach infekcji

Streszczenie

Źródło: Madenspacher, J. H. i Fessler, M. B. Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje proces ilościowego określania obciążenia bakteryjnego śledziony u zakażonej myszy w celu oceny stopnia zakażenia. Zhomogenizowana śledziona jest rozcieńczana seryjnie i pokryta płytami, aby określić całkowite obciążenie bakteriami. Uzyskane dane dostarczają informacji o interakcjach gospodarz-patogen w tkankach układowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Grzybicze aspiracje śródtchawicowe Klebsiella pneumoniae z gardła

1. Upewnij się, że myszy są jednoznacznie identyfikowane po znaku ogona, tatuażu lub innym zatwierdzonym identyfikatorze.
2. Przed wyjęciem myszy z izofluranu należy przygotować inokulum dawkujące bakterie za pomocą pipety P200, aby przyspieszyć procedurę. Dla najlepszych rezultatów aspiracji i.t. użyj objętości <100 μl, aby zapobiec przepełnieniu. W tym przypadku należy użyć 2000 jednostek tworzących kolonie (CFU)/50 μl K. pneumoniae.
3. Znieczulać myszy w przezroczystej komorze gazem izofluranowym (np. 2% izofluranu przy przepływie 1 L/min) lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Liczba myszy do jednoczesnego znieczulenia zależy od poziomu komfortu eksperymentatora, zazwyczaj po 1-2 naraz. Obserwuj oddech i potwierdzaj poziom znieczulenia, gdy widoczne są głębokie oddechy i można odliczyć 2-3 sekundy między oddechami. UWAGA: Jeśli istnieje obawa o możliwe zakłócające efekty lotnych (wdychanych) środków znieczulanych, znieczulenie można osiągnąć zamiast tego za pomocą podania ketaminy/ksylazyny do otrzewnewnej. Przy opisanej powyżej metodzie znieczulenie głębokie trwa tylko kilka minut. Jeśli wywołana jest dłuższa anestezja, należy stosować maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu oczu.
4. Po znieczuleniu mysz ustaw ją w pozycji półleżącej na plecach, zawieszonej na siekaczach szczękowych na gumce naciągniętej między kołkami na skośnej desce z pleksi (Rysunek 1).
5. Delikatnie przesuń język myszy na bok za pomocą tępych, niewyrzeźbionych kleszczy i włóż dawkę do jamy ustnej pipetą P200. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie wywołać urazu języka lub gardła.
6. Trzymając język schowany, delikatnie zatkaj nos palcem w rękawiczce, aż mysz wciągnie powietrze. Kontynuuj zasłanianie nosa, aż mysz wykona dwa lub więcej wdechów i nie będzie widoczna żadna ciecz w jamie ustnej. Zakrycie nosa pomaga mieć pewność, że mysz wdycha bakterie do płuc, ponieważ myszy są obowiązkowymi oddychającymi przez nos.
7. Wyjmij mysz z deski szczepionkowej i wróć do klatki, kładąc mysz na plecach, aby zapobiec zatkaniu nosa lub zanieczyszczeń podczas rekonwalescencji myszy po znieczuleniu.
8. Gdy wszystkie myszy zostaną poddane dawkowaniu i przebudzą się z narkozy, myszy domowe w kabinie/pokoju, w którym są tylko myszy poddane K. pneumoniae. Codziennie monitoruj myszy, w tym masę ciała, jeśli po infekcji nie przekroczą 48 godzin.
9. Używaj codziennego zacierania i/lub dodatkowego ciepła, jeśli pozwolisz myszom wyjść dłużej niż 48 godzin.

2. Określenie obciążenia bakteryjnego w tkankach płucnych i obwodowych

1. Przed rozpoczęciem: przygotować probówki rozcieńczające z 900 μl soli fizjologicznej 1x fosforanowo-buforowanej (PBS) dla płuc i śledziony oraz 90 μl 1x PBS dla krwi. Etykiety do hodowli bakterii i ustaw w temperaturze pokojowej; Dlatego po zebraniu tkanek czas między homogenizacją a płytami na wzrost bakterii zostanie zminimalizowany.
   UWAGA: Ze względu na heterogeniczne osadzanie bakterii w płucach, które może zachodzić podczas aspiracji, zaleca się wykorzystanie pojedynczych myszy do analizy całkowitej komórkowości dróg oddechowych lub całkowitego (obustronnego) obciążenia bakteryjnymi płuc.
2. Uśpiaj myszy zgodnie z wytycznymi instytucji. W tym przypadku należy użyć śmiertelnego zastrzyku 150 mg/kg pentobarbitalu sodu lub równoważnej dawki komercyjnego roztworu eutanazji, po czym następuje wykrwawienie, ponieważ zapobiega to możliwym komplikacjom płucnym związanym z wdychem_CO2 i zwichnięciem szyjki macicy.
3. Usuń śledzionę i wlej ją do 2 ml 1x PBS. Umieść rurki na lodzie. Uważaj, aby wyczyścić instrumenty etanolem pomiędzy każdą chusteczką/myszą.
4. Ujednolicaj tkankę na lodzie, najlepiej za pomocą jednorazowych homogenizatorów, które można zmieniać między każdą próbką. Końcówki jednorazowych końcówek homogenizatorów można autoklawować do ponownego użycia między eksperymentami.
5. Po ujednoliceniu tkanki wykonaj seryjne rozcieńczenia i płytki. Próbki płytek danej tkanki/rozcieńczenia wykonują w duplikacie na pojedynczej płycie tryptycznego agaru sojowego (TSA), rysując linię dzielącą na plastiku. Poniżej przedstawiono sugestie dotyczące płytek i rozcieńczenia (we wszystkich przypadkach na płytkę rozprowadza się 10 μl próbki) i opierają się na 24-godzinnej sekcji zwłok po zakażeniu. Jeśli analizujemy próbki po 48-72 godzinach, może być konieczne zwiększenie liczby rozcieńczeń z powodu zwiększonego obciążenia bakteryjnymi w późniejszych momentach
   1. Dla śledziony – rozcieńcz 1:10-1:100, dodając 100 μl zhomogenizowanej śledziony do 900 μl bezpłodnego 1x PBS szeregowo. Płyta jest ujednolicona, a oba rozcieńczenia są podwójne.
6. Pozwól próbkom na krótko wyschnąć.
7. Odwróć płyty TSA i umieść na noc w statycznym inkubatorze 37 °C.
8. Określ liczbę bakterii kolonizujących, uśredniając kolonie bakterii po obu stronach płytki oraz z każdego rozcieńczenia. Uwzględnić początkowe rozcieńczenia 5 ml dla płuc i 2 ml dla śledziony, aby określić całkowite CFU tkanek.

Wyniki

Rysunek 1: Tablica proceduralna w leczeniu zapalenia płuc aspiracyjnego u myszy. Myszy badawcze są ustawione głową do góry i plecami do deski (czyli półleżące), zawieszone na siekaczkach na gumce naciągniętej między dwa kołki zam...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
Przygotowane wewnętrznie	Nie ma	Woda destylowana (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na₂HPO₄ (5,75 g), KH₂PO₄ (1 g)