Wizualizacja metabolitów aminokwasów w tkankach jelit zakażonych myszy

Streszczenie

Źródło: Specker, J. T. i in. Badanie współpracy mikroorganizmów za pomocą spektrometrii mas Analiza kolonii bakteryjnych rosnących na agarze i w tkankach podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje zastosowanie laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) spektrometrii mas wspomaganej macierzą do wizualizacji rozkładu aminokwasów w tkankach jelit u myszy zakażonych Clostridioides difficile, samodzielnie lub w połączeniu z Enterococcus faecalis. Procedura obejmuje przygotowanie tkanek, aplikację matrycy, jonizację laserową oraz wykrywanie jonów aminokwasowych w celu uzyskania przestrzennych obrazów jonowych. Wyniki ujawniają współpracę mikroorganizmów, ponieważ E. faecalis zmienia środowisko jelitowe, uwalniając ornitynę i wyczerpując argininę, co zwiększa patogenezę C. difficile .

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie i wysyłka niezakażonych tkanek grzybowych myszy zakażonych C. difficile
   1. Zaszczepić 4-8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 antybiotykami (0,5 mg/mL cefoperazonu lub 0,5 mg/mL cefoperazonu + 1 mg/ml wankomycyny) w wodzie pitnej ad libitum przez 5 dni, po czym następuje 2-dniowy okres rekonwalescencji i późniejsze zakażenie.
   2. Uśpij zwierzęta przez uduszenie_CO2 i natychmiast pobierz narząd mózgu myszy. Umieść w 20% mieszance związku o wysokiej temperaturze cięcia (OCT) w wodzie destylowanej.
   3. Umieszczać próbki na suchym lodzie, a następnie pakować i wysyłać do analizy; przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.

 

2. Kriosekcja niezakażonej grupy kontrolnej kontra tkanki zakażone C. difficile myszy

1. Wyczyść cały sprzęt do kriosekcji, płucząc go 100% etanolem i pozwól wyschnąć przed umieszczeniem próbek w komorze kriostatu. Przygotuj szkiełka mikroskopowe pokryte powłoką ITO, używając ohmmetru do identyfikacji boku szkiełka z przewodzącą powłoką. Użyj diamentowego skrawera do trawienia i oznaczania strony szkiełka mikroskopowego pokrytego ITO.
   UWAGA: Należy nosić odpowiedni osobisty sprzęt ochronny, w tym rękawice, okulary laboratoryjne, fartuch laboratoryjny oraz rękawy kriostatu.
2. Wykonaj kriosekcję na kriomikrotomie badawczym. Przenieś tkanki ceca myszy w OCT z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory kriomikrotomu (temperatura komory 30 °C, temperatura obiektu -28 °C) na suchym lodzie. Zamontuj próbki tkanek do porównania za pomocą spektrometrii mas obrazowej (np. kontrola niezakażona vs. C. difficile) na tym samym szkiełku mikroskopowym, aby zapewnić identyczne przygotowanie próbek obu typów tkanek i umożliwić dokładne porównania metabolitów.
3. W komorze kriomikrotomu zamontuj tkankę osadzoną w OCT na chryzancie próbki, używając dodatkowego roztworu OCT. Po zastygnięciu roztworu OCT przymocuj uchwyt do głowicy próbki. Rozpocznij kriosekcję w przyrostach 10-50 μm, aby osiągnąć pożądaną głębokość/płaszczyznę tkanki narządu.
4. Gdy uzyskasz optymalny przekrój poprzeczny tkanki, rozpocznij pobieranie przekrojów o grubości 12 μm. Delikatnie manipuluj kawałkiem pędzlami artystycznymi i umieść go na szkiełku mikroskopowym pokrytym teflonem.
5. Nawij szkiełko mikroskopowe pokryte ITO na przekroju tkanki, aby pobrać tkankę z preparatu pokrytego teflonem. Rozmrażanie tkanki przymontuje się do szkiełka mikroskopu, przyciskając dłoń do tylnej części szkiełka pokrytego ITO. Kontynuuj rozmrażanie osadu, aż przekroj tkanki przejdzie z przezroczystej na matową/nieprzezroczystą fakturę.
6. Przenieś szkiełka mikroskopu tkankowego na suchym lodzie do pudełka z osuszaczem do przechowywania na potrzeby analizy tego samego dnia lub przechowywać w temperaturze -80 °C dla dłuższego przechowywania.

3. Przygotowanie niezakażonej grupy kontrolnej w porównaniu z tkankami zakażonymi C. difficile myszy do aplikacji w matrycy oraz spektrometrią mas MALDI

1. Wykonaj aplikację matrycy MALDI (temperatura dyszy 30 °C, osiem przejść, przepływ 0,1 mL/min, wzór CC, 0 s czas schnięcia, 10 psi).
2. Wykonaj obrazowanie spektrometrii mas MALDI
3. Przeanalizuj obrazy jonów z wielu biologicznych replikacji i porównaj wyniki pod kątem istotności za pomocą porównań na wykresach intensywności, korzystając z powyższego oprogramowania statystycznego SCiLS.
   UWAGA: Odpowiednie testy statystyczne i porównania zależą od zastosowania i mogą obejmować segmentację przestrzenną, modele klasyfikacyjne oraz analizę porównawczą w celu określenia cech spektralnych i sprzężonych z rozróżniającymi. Analizy porównawcze mogą obejmować przypisywanie wartości p istotnym cechom, generowanie analiz głównych składników do porównań tkanek oraz wizualizację wykresów pudełkowych w celu identyfikacji zmienności. Przydatne jest także wizualizowanie tkanki za pomocą mikroskopii jasnego przekroju tkanki barwionej hematoksyliną i eozyną (H&E) po spektrometrii mas obrazowej. Pozwala to na wyraźną identyfikację cech morfologicznych tkanki i może być analizowane w konsultacji z wykwalifikowanym patologiem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nylonowe filtry strzykawkowe Titan3 o pojemności 0,2 μm	Thermo Scientific	42225-NN
Macierz MALDI 1,5-diaminonaftalenu	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 mL strzykawek Henke Ject luer lock	Henke Sass Wolf	4200.000V0
Seria 275i konwekcyjna próżnia	Firma Kurta J. Leskerzy	KJL275807LL
7T solariX FTICR spektrometr masowy wyposażony w system laserowy Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Roztwór kwasu octowego, odpowiedni dla HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitryl, odpowiedni do HPLC, gradientowy stopień, ≥99,9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Roztwór wodorotlenku amonu, 28% NH3 w H2O, ≥99,99% metali śladowych	Sigma Aldrich	1336-21-6
Autoklawowalne worki na zagrożenie biologiczne: 55 galonów	Grainger	45TV10
Worki transportowe z biohazardem biologicznym (8 x 8 cali)	Fisher Scientific	01-800-07
Bulion z wlewem do serca mózgu	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 samców myszy	Jackson Laboratories
Skaner zdjęć i dokumentów CanoScan 9000F Mark II	Kanon
Badawczy kriomikrotom CM 3050S	Leica Biosystems
Szafka osuszająca	Sigma Aldrich	Z268135
Skrybator z diamentowymi końcówkami, Nauki o mikroskopii elektronowej	Fisher Scientific	50-254-51
Granulki suszarki dryrytowej	Drierit	21005
Etanol, 200 proof	Decon Labs	2701
Oprogramowanie flexImaging	Bruker Daltonics
oprogramowanie ftmsControl	Bruker Daltonics
Szklana pułapka próżniowa	Sigma Aldrich	Z549460
Robotyczny spryskiwacz HTX M5 TM	HTX Technologies
Szkiełka mikroskopowe pokryte tlenkiem cyny indu (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Filtr HEPA w linii do pompy próżniowej	LABCONCO	7386500
Metanol, klasa HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Adapter do suwaka MTP II	Bruker Daltonics	235380
Optymalna temperatura cięcia (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU Sporicid, środek dezynfekujący i środek czyszczący	CONTEC	CR85335
Szkiełka drukowane PTFE (teflon), nauki o mikroskopii elektronowej	VWR	100488-874
Obrotowa pompa próżniowa RV8	Edwards	A65401903
Jednorazowe mikrotomowe łopatki Tissue-Tek Accu-Edge o profilu	Nauki o mikroskopii elektronowej	63068-KM
Przezroczysta rurka próżniowa	Cole Palmer	EW-06414-30
Olej do pompy próżniowej Ultragrade 19	Edwards	H11025011
Transformator zmiennego napięcia	Powerstat
Woda, odpowiednia do HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Kolba Dewara z szerokim ustem	Sigma Aldrich	Z120790