Ocena wpływu inhibitorów na tworzenie pelikuli u Bacillus subtilis

Streszczenie

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje test tworzenia pelikuli z użyciem Bacillus subtilis do oceny inhibitorów małych cząsteczek zakłócających syntezę matrycy i rozwój biofilmu, dostarczając modelu do przesiewania związków selektywnie hamujących wzrost związany z powierzchnią, nie wpływając na swobodnie unoszące się komórki.

Protokół

1. Ocena wpływu inhibitorów małych cząsteczek na tworzenie kolonii pellicle i biofilmu

1. Przygotuj 2x roztwór zdefiniowanego biofilmu indukującego MSgg (monosodowy glutaminian-glicerol) bez chlorku wapnia i heksahydratu żelaza(III). Po sterylizacji filtrem dodaj chlorek wapnia. Medium jest gotowe do bezpośredniego użycia lub może być przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności.
2. Przygotuj rozcieńczenie 1x MSgg w dniu eksperymentu.
   1. Rozcieńcz 2x medium MSgg do 1x za pomocą sterylnej wody destylowanej (pellicles) lub sterylnego 3% gorącego (80 °C) agaru (biofilmy) i dodaj chlorek żelaza(III) do końcowego stężenia 50 μM (pellicles) lub 250 μM (biofilmy). Dodaj antybiotyki lub inhibitory małocząsteczkowe do pożądanego stężenia i dobrze wymieszaj. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM D-leucyny w 30 ml, aby ustanowić pellicle lub biofilmy, należy dodać 196,6 μl roztworu zapasowego D-leucyny o pojemności 76,3 mM (10 mg/ml).
      UWAGA: Ostateczna kompozycja 1x MSgg opisana jest w Tabeli 1. W porównaniu do oryginalnego przepisu, podłoże zawierało 50 μg/ml treoniny, a stężenie żelaza potrzebne do uprawy kolonii biofilmu na stałym nośniku MSgg wzrosło 2,5-krotnie, aby zoptymalizować morfologię pomarszczonej kolonii.
3. Po zastygnięciu agaru susz stałe płytki MSgg w biologicznej pokrywie przez 30-45 minut przed inokulacją.
4. Aby wybrać konkretne inhibitory zakłócające mechanizmy powstawania pellicle (Rysunek 1), wyklucz, że stosowane stężenia wpływają na wzrost planktonu i statycznego.
   1. Określ wzrost planktonu (wzrost gęstości optycznej w czasie w hodowli ciekłej) na prostej krzywej wzrostu, mierząc gęstość optyczną na poziomie 600 nm co godzinę aż do fazy stacjonarnego wzrostu.
   2. Aby potwierdzić, że zmierzona mętność hodowli odzwierciedla liczbę żywych komórek, należy określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) komórek w fazie wzrostu planktonicznego na podstawie potrząsającej hodowli w kilku punktach czasowych.
   3. Aby ocenić wpływ inhibitorów małych cząsteczek na wzrost statycznej pelikul, pobierz komórki po 3-dniowej inkubacji w temperaturze 23 °C z dołku do hodowli komórek z 24 dołkami, zaszczepionymi w takich warunkach jak opisane w sekcjach 1.7-1.9, i określ CFU. Do tej kontroli stosuje się odkształcenie niedoborowe pellikuli, które nie zawiera operonów kodujących składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (np. B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
      UWAGA: Ten szczep jest zdolny do wzrostu w warunkach statycznych, ale w przeciwieństwie do dzikiego typu tworzącego pellicle, brakuje mu zdolności do unoszenia się na granicy ciecz-powietrze, gdzie wzrost sprzyja ze względu na wzrost poziomu tlenu. Dlatego ten niedobór macierzy zewnątrzkomórkowej i pellikuli jest zalecanym szczepem referencyjnym do oceny wzrostu w warunkach statycznych.
      UWAGA: W przypadku konkretnego przykładu niekanonicznego D-aminokwasu D-leucyny opisanego poniżej wykluczono wpływ na wzrost planktonu i statyczny w stężeniach zakłócających tworzenie pelikul. Szczegółowo opisano metody określania wzrostu planktonicznego i statycznego.
5. Wyciągnij B. subtilis z zapasu o temperaturze -80 °C (hodowla LB zawierająca 10^{9 komórek} /ml zamrożonych w 20% glicerole), aby wyizolować pojedyncze kolonie na płytkach agarowych LB-1,5% za pomocą sterylnej końcówki lub stosującego.
6. Uprawiaj przez noc w temperaturze 30 °C.
7. KLUCZOWY KROK: Aby zapewnić silną hamowanie pelikuli przez niekanoniczne D-aminokwasy, takie jak D-leucyna, hodować pojedynczą kolonię pobraną z płytki agarowej LB-1,5% w bulionie 3 ml LB w 37 °C przez 4 godziny w inkubatorze potrząsającym (prędkość wstrząsania 200 rpm). Zastąpić bulion LB podłożem MSgg indukującym biofilm przed inokulacją, wirując 1,5 ml hodowli starterowej przez 4 minuty przy 6 000 x g, ostrożnie usuwając supernatant i ponownie zawiesując granulat w podłożu MSgg o pojemności 1,5 ml. Resztę kultury można odrzucić. Ważne: Aby zapewnić odporność systemu, gęstość optyczna przy 600 nm (OD₆₀₀) wypranej kultury startowej powinna wynosić od 0,6 do 1.
8. Podczas wzrostu hodowli startowej przygotuj wielokomórkową płytkę wielokomórkową z 12 dołkami zawierającą 3 ml podłoża MSgg bez lub z zakresem stężenia inhibitora małocząsteczkowego (np. 0,3, 0,5, 1 mM D-leucyny). Aby wykluczyć efekty brzegowe, rozłóż położenie różnych stężeń na wielonaczyniowej płycie. Alternatywnie można użyć wielokomórkowych płytek wielokomórkowych z 24-dołkową masą 1,5 ml podłoża MSgg.
9. Zaszczep dołki wielokomórkowej płyty wielokomórkowej z 12 dołkami 3 μl wymytej kultury startowej (rozcieńczenie 1:1 000).
   UWAGA: Można zastosować niższy współczynnik rozcieńczenia, czyli 1:500. To skraca czas rozwoju pellicli.
10. Pellicle uprawiaj w temperaturze 23 °C w warunkach statycznych przez trzy dni. Nie przesuwaj pellicli w tym czasie, ponieważ może to wpłynąć na ostateczną morfologię powierzchni pelikuli.
11. Rób zdjęcia za pomocą lornetki i jednorodnej ekspozycji błyskawic. Alternatywnie, zrób zdjęcie pellicli aparatem o wysokiej rozdzielczości. Aby uniknąć artefaktów spowodowanych nieregularnymi kątami świetlnymi i cieniami, rób zdjęcia z góry aparatem zamocowanym na statywie i używaj miękkiego, dużego źródła światła pod kątem 45° z obu stron.
    UWAGA: Alternatywną metodą badania wielokomórkowości B. subtilis jest test kolonii biofilmu na stałym, biofilmowym nośniku MSgg. Podobnie jak pellicles, ten test umożliwia badanie procesów czasoprzestrzennych. Gdy określi się aktywny zakres inhibitorów małych cząsteczek, można badać ich wpływ na tworzenie kolonii biofilmu.
12. Aby uprawiać kolonie biofilmu, symetrycznie umieść 1,5 μl nieumytego pre-hodowla (Krok 1.7) na suszonej płycie MSgg z 1,5% agaru przy użyciu szablonu — 4 krople na szalkę Petriego o średnicy 8,5 cm. Pozwól kroplom wchłonąć się na płytę, zanim je przeniesiesz.
    UWAGA: Szablon pomaga uzyskać równomierny rozkład kolonii biofilmu w obszarze, gdzie hodowane są komórki. Aby przygotować szablon, narysuj całkowity obszar wzrostu w pierwotnych skalach, podziel go na równe sektory i zaznacz centrum. Dla okrągłej szalki Petriego o średnicy 8,5 cm, przypisuje się to 14 cm² do jednej kolonii biofilmu.
13. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni. W tym czasie kolonie biofilmu rozwijają się i tworzą trójwymiarową, pomarszczoną strukturę.
14. Rób zdjęcia jak w kroku 1.11.

Tabela 1. Ostatnia 1x esposja MSgg użyta w tym badaniu.

1,925 mM	Fosforan potasu monozasadowy
3,075 mM	Dwubaziz fosforanu potasu
100 mM	3-(N-morfolino)propanosulfonowy kwas o pH 7,1
2 mM	Heksahydrat chlorku magnezu
700 μM	Chlorek wapnia bezwodny
50μM a	Chlorek żelaza(III) heksahydrat
125 μMb
1 μM	Chlorek cynku bezwodny
2 μM	Chlorek tiaminy
50 μg/ml	Tryptofan
50 μg/ml	Fenyloalanina
50 μg/ml	Threonine
0,5% (v/v)	Glicerol bezwodny
0,5% (w/v)	Hydrat soli sodowej z kwasem L-glutaminowym
Ado testu pellicle; bjak biofilm assay

Wyniki

Rysunek 1. Przegląd koncepcyjny dla identyfikacji solidnego wyposażenia eksperymentalnego do oceny specyficznego hamowania powstawania biofilmu. Kryteria selekcji dla inhibitorów małych cząsteczek, które wskazują na specyficzne zakłócenia w ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion Luria, Lennox	Difco	240230
Fosforan potasu monozasadowy	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Dwubaziz fosforanu potasu	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
3-(N-morfolino)propanosulfonowy kwas	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Heksahydrat chlorku magnezu	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Chlorek wapnia bezwodny	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Chlorek manganu(II) tetrahydrat	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Chlorek żelaza(III) heksahydrat	Sigma, 270,30 g/miesiąc)	F2877-500G
Chlorek cynku bezwodny	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Chlorek tiaminy	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-tryptofan	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenyloalanina	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonina	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glicerol bezwodny	Bio-Lab Itp	712022300
Sole sodowe kwasu L-glutaminowego nawadniają	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucyna	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Bezwodny etanol	Gadot	830000054
Wstrząs 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Wirówka	Wirówka stołowa Eppendorf 5424	NA
Inkubator 30 °C	Segregator	NA
Inkubator 23 °C	Segregator	NA