Test odporności na etanol w celu oceny integralności matrycy biofilmu

Streszczenie

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje, jak integralność matrycy biofilmu wpływa na odporność bakterii na etanol, porównując jednostki tworzące kolonie w biofilmach nieleczonych i zaburzonych przez inhibitory. Zmniejszone CFU w próbkach objętych inhibitorami pokazują, że macierz zewnątrzkomórkowa jest niezbędna do ochrony komórek osadzonych w biofilmie przed stresem przeciwdrobnoustrojowym.

Protokół

1. Test oporności na etanol

1. Hodować biofilmy, a po 68 godzinach wzrostu w temperaturze 30 °C pokróć kolonie biofilmu na dwie równe części za pomocą żyletki i szablonu.
2. Ostrożnie podnieś każdą połowę kolonii biofilmu z płytki agarowej za pomocą małej łopatki i przenieś ją do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Jeśli to konieczne, zeskrobaj pozostałe komórki z płyty i przenieś je również do rurki mikrowirówki.
   UWAGA: Druga połowa kolonii biofilmu jest traktowana różnicowo, w zależności od tego, czy jest to środek kontrolny, czy w celu testowania odporności na środki sterylizujące.
3. Do kontroli inkubuj drugą połowę kolonii biofilmu w 500 μl PBS. Aby ocenić odporność na środki sterylizujące, przelej drugą połowę kolonii biofilmu do etanolu 500 μl 50% (v/v).
   UWAGA: Można stosować alternatywne środki sterylizujące, takie jak podchloryn sodu. Dla wszystkich używanych środków sterylizujących określ stężenie aktywne i czas inkubacji w eksperymencie wstępnym.
4. Inkubuj kolonie biofilmu przez 10 minut na blacie stołu w temperaturze pokojowej.
5. Wirówka w koloniach biofilmu przez 5 minut w 18 000 x g i ostrożnie usuwa supernatant pipetą. Dodaj 300 μl PBS.
6. Delikatnie sonikatuj komórki (amplituda 10%, puls 5 sekund) mikrokońcówką sonikatora.
   UWAGA: Energia sonikacji musi być wystarczająca, aby oddzielić agregaty biofilmu. Jednak zbyt mocna sonikacja może rozbić komórki. Potwierdź z wyprzedzeniem za pomocą mikroskopu świetlnego, że użyta energia sonikacji nie lizuje komórek i że wszystkie agregaty są rozpuszczone.
7. Dodaj 700 μl PBS do końcowej objętości 1 ml. Wykonaj seryjne rozcieńczenie (do ^10-7) w PBS i rozprowadz 100 μl 3 rozcieńczeń na płycie agarowej LB-1,5% za pomocą sterylnych szklanych kulek.
   UWAGA: Optymalne rozcieńczenia do powlekania powinny być ustalone w eksperymencie wstępnym, ponieważ zależy to od liczby komórek w interesującej kolonii biofilmu oraz wskaźnika przeżycia komórek w odpowiedzi na działanie środka sterylizującego.
8. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 °C, licz CFU i określaj CFU/ml. Z końcowej wartości CFU/ml każdej połowy kolonii biofilmu oblicz procent ocalałych.
   UWAGA: Po przeprowadzeniu i analizie zgodnie z opisem, dwie połowy kontrolnej kolonii biofilmu oraz nieobtraktowana a etanolowa połowa nieobtraktowanej kolonii biofilmu powinny wykazywać różnice poniżej 10% w liczbie żywotnych komórek, co potwierdza symetrię lub odporność kolonii. Alternatywnie, wyniki mogą być przedstawione w całkowitej liczbie CFU. Liczba komórek kolonii kontrolnej i nieobrobionej biofilmu powinna pozostać w tym samym rzędzie wielkości. Dla porównania, liczba komórek w etanolem poddawanej etanolowi połowie kolonii biofilmu poddawanego małocząsteczkowym ma spadnąć co najmniej o dwa rzędy wielkości, aby świadczyć o zwiększonej wrażliwości na środek sterylizujący.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion Luria, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Fosforan potasu monozasadowy	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Dwubaziz fosforanu potasu	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
3-(N-morfolino)propanosulfonowy kwas	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Heksahydrat chlorku magnezu	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Chlorek wapnia bezwodny	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Chlorek manganu(II) tetrahydrat	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Chlorek żelaza(III) heksahydrat	Sigma, 270,30 g/miesiąc)	F2877-500G
Chlorek cynku bezwodny	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Chlorek tiaminy	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-tryptofan	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenyloalanina	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonina	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glicerol bezwodny	Bio-Lab Itp	712022300
Sole sodowe kwasu L-glutaminowego nawadniają	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucyna	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Bezwodny etanol	Gadot	830000054
Żyletka	Eddison	NA
Okrągłe papiery filtrujące celulozę	Co, 90 mm	1001-090
Glutaraldehyd	EMS (Elektronon Micoscopy Science), 25% w wodzie	16220
Paraformaldehyd	EMS, 16% w wodzie	15710
Kakodylan sodu	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Chlorek wapnia 2-hydrat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Wstrząs 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Wirówka	Wirówka stołowa Eppendorf 5424	NA
Cyfrowy Sonifier, Model 250, używany z Double Step Microtip	Branson	NA
Inkubator 30 °C	Segregator	NA
Inkubator 23 °C	Segregator	NA
System filtracyjny, 500 ml, polistyren	Cornig Incorporated	NA
Rotacyjny wstrząs - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA