Metoda komorowego szkła pokrywowego do tworzenia biofilmu bakteryjnego in vitro

Streszczenie

Źródło: Beaudoin, T. i inni. Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu osłonowego. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje użycie komorowego szkła osłonowego do badania wpływu czynników gospodarza plwociny pochodzących od pacjentów z mukowiscydozy na rozwój bakteryjnego biofilmu.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IRB instytutu.

1. Metoda komorowego szkła pokrywowego do tworzenia biofilmu
   1. Uprawiaj interesujący izolat bakteryjny przez noc w pożądanym podłożu w temperaturze 37 °C i wstrząsając (200 obr./min).
      UWAGA: Wykorzystano różne bakterie, w tym izolaty kliniczne Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, kompleks Burkholderia cepacia oraz Achromobacter xylosoxidans. Wybór podłoża zależy od szczepów i warunków zainteresowania, jednak (wyrę Luria) można stosować medium LB do eksperymentów początkowych.
   2. Z nocnej hodowli umieść 40 μl hodowli w 4 ml świeżego podłoża i uprawiaj przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z utrząśnięciem (200 obr./min), aby uzyskać hodowlę o gęstości optycznej 600 nm (OD600) około 0,5-0,6.
   3. Rozcieńcz hodowlę od kroku 1,2 do 1/5 w pożądanym podłożu z 10% filtratem plwociny lub bez filtratu plwociny (jako kontrola). Inne stężenia filtrianu plwociny można badać (np . 50% lub 100%).
   4. Użyj 200 μl rozcieńczenia do zasiewań komor ślizgowych.
   5. Pozwól bakteriom przywierać się przez 4 godziny w temperaturze 37 °C bez potrząsania.
   6. Po 4 godzinach usuń podłoże i delikatnie umyj biofilm jednym razem świeżym medium. Zamień na 200 μl świeżego medium.
      UWAGA: Aby zbadać wpływ plwociny na biofilm, świeże medium powinno zawierać nadnanatant plwociny.
   7. Pozwól biofilmom rosnąć przez pożądany czas w temperaturze 37 °C bez potrząsania, wymieniając medium co 12 godzin, bez mycia aż do czasu mikroskopii.
      UWAGA: Aby zbadać wpływ nadnaczyń plwociny na podatność na biofilm antybiofilmowy, antybiotyki są dodawane do podłoża po 24 godzinach wzrostu biofilmu i utrzymywane w podłożu aż do barwienia i obrazowania biofilmów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lab-Tek II Komorowe szkło pokrywowe, #1.5 borokrzemian, 8-dołkowy	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standardowe medium do wzrostu nocnego/biofilmu