Konfokalne obrazowanie biofilmów bakteryjnych indukowanych przez filtry plwociny u pacjentów z mukowiscydozą

Streszczenie

Źródło: Beaudoin, T. i inni. Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu osłonowego. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film prezentuje metodę in vitro do oceny, jak plwocina mukowiscydozy pochodząca od pacjentów wpływa na tworzenie biofilmu bakteryjnego. Za pomocą szkiełek komorowych, barwienia fluorescencyjnego oraz mikroskopii konfokalnej ujawnia się zwiększona grubość, zmieniona architektura oraz wyższa żywotna biomasa w biofilmach hodowanych ze plwociną, podkreślając rolę składników gospodarza w kształtowaniu rozwoju biofilmu.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IRB instytutu.

Biofilmy barwiące i mikroskopia konfokalna

1. Po odpowiednim czasie wzrostu (najlepiej 24-48 godzin) usuń medium z komor i delikatnie przemyj każdą komorę dwukrotnie 300 μl sterylnego PBS.
2. Przygotuj mieszankę barwiącą do biofilmu, mieszając po 1 μl każdego barwnika (dostarczonego w zestawie żywotności) na każdy ml potrzebnego roztworu. Rób barwnik w wodzie lub roztworze medium.

UWAGA: Woda jest zalecana przez producenta.

3. Dodaj 200 μl mieszanki barwnikowej do każdej komory szklanej pokrywy i inkubuj w temperaturze pokojowej, w ciemności przez 45 minut.
4. Usuń mieszankę barwiącą z komór i przepłucz każdą jamkę 300 μl sterylnego PBS. Usuń PBS i zamień go na wodę świeżą lub media.
5. Przejdź do wizualizacji biofilmów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lab-Tek II Komorowe szkło pokrywowe, #1.5 borokrzemian, 8-dołkowy	Thermo Sicher Scientific	155409
Zestaw do wykorzystania biofilmu Filmtracer Live/Dead	Thermo Fisher Scientific	L10316
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standardowe podłoże do wzrostu gowth/biofilmu przez noc
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (Dulbecco A)	Oksoid	BR0014G	Mycie komór biofilmowych po usunięciu nośnika
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss