Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Streszczenie

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Protokół

1. Zakażenie przenoszone przez żywność danio pręgowanego
   1. Inkubuj bakterie z Paramecią.
      1. Przygotuj współhodowlę Paramecium caudatum i Escherichia coli MG1655 w noc poprzedzającą infekcję. Połącz 8 mL podłoża E3, 1 mL trwającej hodowli paramecji oraz 1 mL hodowli E. coli MG1655 (OD₆₀₀ = 1,0) ponownie zawieszonych w 1x E3 w kolbach do hodowli tkanek T25. Kolby inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez noc. Na każdą schorzenie przygotuj dwie kolby z paramecjami.
      2. Zaszczep pożywkę wzrostu bakterii (LB (Lysogeny Broom): 1 g/l tryptonu, 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego, 1 g/L NaCl) zakaźnym szczepem bakterii, pobierając pojedynczą kolonię bakterii z płytki za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej. Inkubuj płynną hodowlę w temperaturze 37 °C i pozostawiaj wstrząsanie z prędkością 110 obrotów na minutę (rpm) przez całą noc.
         UWAGA: Należy nosić środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny i rękawiczki), a przy obsłudze z czynnikami zakaźnymi należy stosować urządzenia o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
      3. Następnego dnia zmierz OD₆₀₀ nocnej kultury. Oblicz objętość hodowli potrzebną do osiągnięcia OD600 1 po ponownym zawieszeniu w 11 mL podłoża.
      4. Pobieraj objętość bakterii przez wirowanie w ilości 6 000 x g przez 5 minut, po jednej objętości na każdą kolbę paramecji. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 1 mL podłoża E3.
      5. Opcjonalnie należy wstępnie zabarwić bakterie fluorescencyjnym barwnikiem.
         1. Dodaj 1 μL bakteryjnego barwnika FM 4-64FX (5 mg/mL roztworu wywarowego). Okryj tubkę folią, aby chronić przed fotobieleniem i inkubuj obracanie się na końcu w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
         2. Usuń nadmiar barwnika, myjąc bakterie 1x E3: Pellet przez wirowanie w stężeniu 6 000 x g przez 1,5 minuty, a następnie ponownie zawiesij granul w 1 mL podłoża E3. Powtórz krok mycia dwa razy.
         3. Zbieraj bakterie barwione przez cntrifugację w ilości 6 000 x g przez 5 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 1 mL podłoża E3.
      6. Dodaj 1 ml zawiesiny bakteryjnej do każdej z dwóch kolb świeżych paramecji. Inkubuj w RT przez 2 godziny.
         UWAGA: Jeśli pracujesz z zabarwionymi bakteriami, inkubuj w ciemności na RT przez 2 godziny
2. Kokultura bakterii płukania/paramecji
   1. Połącz zawartość obu kolb z kokulturą paramecji i bakterii w stożkowej probówce o pojemności 50 mL. Próbki z wirówki w dawce 300 x g w 15 °C przez 10 minut. Upewnij się, że wirówka jest wstępnie schładzona przed tym krokiem.
   2. Usuń około 10 mL supernatantu E3 pipetą serologiczną i dodaj około 10 mL świeżego 1x E3 do stożkowej rurki.
      UWAGA: Podczas wszystkich etapów płukania niezwykle szybkie jest usuwanie supernatantu, ponieważ paramecje zaczną wypływać z pelletu. Obracaj i usuwaj supernatant z jednej rurki na raz, aby zapewnić wystarczająco szybkie obsługiwanie się na tym etapie i uniknąć utraty paramecji w supernatancie.
   3. Próbki wirować w 300 x g w 15 °C przez 5 minut. Usuń około 10 mL supernatantu E3 pipetą serologiczną i dodaj około 10 mL świeżego 1x E3 do stożkowej rurki. Powtórz ten krok dwa razy.
   4. Próbki z wirówki w dawce 300 x g w 15 °C przez 5 minut. Usuń około 10 ml supernatantu E3, uważając, aby nie zakłócić granulacji.
   5. Ponownie zawiesz pellet do pozostałych 10 mL nośnika E3 i przelej 500 μL zawiesziny do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Granulować 500 μL paramecji, wirując w 300 x g przez 5 minut, aby policzyć liczbę paramecji.
   6. Usuń 400 μL supernatantu E3 z próbki 500 μL. Dodaj 20 μL roztworu 36,5% formaldehydu do pozostałych 100 μL paramecji, delikatnie ponownie zawiesij, inkubuj przez 5 minut w temperaturze 22 °C.
      UWAGA: Ten krok zabija paramecię, aby umożliwić liczenie.
   7. Zmierz rzeczywistą całkowitą objętość pipetą i nagrywaj. Rozcieńcz zawieszenie paramecia 1:1 V/V roztworem 0,4% trypan.
   8. Użyj licznika komórek lub hemocytometru, aby policzyć liczbę martwych paramecji na mL.
      UWAGA: Z powodu wcześniejszego etapu fiksacji większość paramecji będzie martwa w tym momencie, ale ta liczba odzwierciedla liczbę żywych paramecji w eksperymencie współinkubacji. Autorzy nie stwierdzili istotnej śmierci z powodu paramecji spowodowanej współinkubacją bakterii, więc można to pominąć jako czynnik.
3. Współinkubują larwy Paramecji i danio prano
   1. Oblicz stężenie paramecji w stożkowej rurce o pojemności 50 mL
   2. Oblicz objętość wypłukanych paramecji wymagana dla stężenia 2 x 10⁵ paramecja/mL w końcowej objętości 3 mL E3.
      UWAGA: Stężenie paramecji można dostosować w zależności od pożądanej dawki bakterii, co podlega optymalizacji.
   3. Znieczulaj danio pręgowane, dodając tricainę w 100 mM o pH 8,0 do końcowego stężenia 100 mg/L. Przelej 10 danio pręgowanych do każdego dołku na 6-dołowej płytce do objętości 3 mL świeżego E3 zawierającego odpowiednie stężenie paramecji. Upewnij się, że larwy są przenoszone w minimalnej ilości płynu, aby zapewnić im powrót do zdrowia po znieczuleniu w dołku biorcy.
   4. Inkubuj w temperaturze 30 °C przez 2 godziny w inkubatorze dziennym w warunkach dziennych, aby zapewnić optymalne warunki oświetleniowe dla polowania.
   5. Myj danio pręgowanego co najmniej 5 razy, przelewając ryby do nowej studni zawierającej 3 mL świeżego E3 z 100 mg/L tricainy za każdym razem.
      UWAGA: Nie próbuj pomijać tricainy podczas mycia. Przenoszenie mobilnych larw bez znieczulenia zwiększa ryzyko uszkodzeń i niepokoju zwierzęcia.
   6. Opcjonalnie przygotuj danio danio do obrazowania, osadzając danio pręgowanego w 3 mL 1% niskotopnionej agarozy w czarnościennej płytce 6-dołkowej: agaroza o niskim stopniu jest przygotowywana w 1xE3 i podgrzewana w mikrofalówce. Po stopieniu dodaj tricainę do końcowego stężenia 160 mg/mL. Umieść ryby pod stereomikroskopem, używając przyciętej żelowej końcówki ładowającej, upewniając się, że głowica jest po lewej, a ogon po prawej stronie (Rysunek 1). Poczekaj 5 minut, aż agaroza się zwiesnie, a następnie nałóż na osadzoną rybę 1x E3 zawierającą 160 mg/mL tricainy do obrazowania.

Wyniki

Rysunek 1: Kolonizacja danio dano przez bakterie. Danio w wieku 5 dpf pozostawiono niezakażone (A) lub skolonizowano mCherry ekspresującą (B) E. coli lub (C) Salmonella enterica ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Paramecium caudatum, na żywo	Carolina	131554	Nie, nie przechowuj kultur poniżej temperatury pokojowej
0,4% Trypan Blue Solution	Sigma	T8154-20ML	płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych; przygotowany w 0,81% chlorku sodu i 0,06% fosforanie potasu, dibazicznie
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma	276855-100ML	przechowywać w szafce bezpieczeństwa na rozpuszczalniki
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	może zostać zastąpiony dowolnym innym niepatogennym szczepem E. coli
Bejca FM 4-64FX	Thermo Fisher	F34653	aliquot i przechowywanie mrożonka
Formaldehyd	Sigma	F8775-4X25ML
LB Bulion	Sigma	L3397-1KG
Tabletki soli fizjologicznej z buforem fosforanowym	Thermo Fisher	18912014
Tetracyklina	Sigma	87128-25G	toksyczne, drażniące
Trikaina (metansulfonian etylot3-aminobenzoanu)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Roztwór Trypan Blue 0,4%	Sigma	93595-50ML
Ultraczysta agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Thermo Fisher	16520050
Hemocytometr lub licznik komórek	dowolny
Stereomikroskop	dowolny
Wirówka stołowa
Mikrofala
Koło rotatorowe
Podgrzewany inkubator wstrząsający
Obiekty wodne
Zbiorniki hodowlane