1. Obserwacja lokalizacji SKN-1 w odpowiedzi na zakażenie Streptococcus gordonii <ol><li>Dodaj ~100 larw L4 do każdego ekstraktu drożdżowego Todd–Hewitt (THY) zasianego Streptococcus oraz do każdej płytki agarowej na podłożu nicieni (NGM) z nasionami Escherichia coli (E. coli). Używaj trzech płytek na szczep bakterii. Inkubuj płytki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 25 °C.</li><li>Następnie wyjmować płytki z inkubatora, przemyć je zmodyfikowanym buforem M9 (M9W) i zebrać robaki w stożkowych tubkach o pojemności 15 mL.</li><li>Umyj robaki 3 razy.</li><li>Usuwa większość M9W przez aspirację i dodaje 500 μL M9W zawierającego 2 mM azydu sodu lub 2 mM chlorowodorku tetramilu do pelletu robaka. To znieczuli robaki, zapewniając, że podczas badania pod mikroskopem nie dochodzi do żadnego ruchu. UWAGA: Używaj środków ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z azydem sodu. Przygotuj roztwór azydu pod chemiczną pokrywą.</li><li>Inkubuj granulki robaków w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut. Następnie umieść 15 μL zawiesziny robaka na przygotowanej agarozowej podkładce. Delikatnie nałóż pokrywkę nr 1.5 na agarozową poduszkę zawierającą znieczulone robaki.</li><li>Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zwizualizuj lokalizację czynnika transkrypcyjnego rodziny Skinheadów 1, czyli SKN-1:GFP (SKN-1 oznaczonego Green Fluorescent Protein-tag), wykorzystując izotiocjanian fluoresceiny (FITC) oraz filtry 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI). Robaki obrazowe przy powiększeniach 10x i 20x.</li><li>Oceniaj robaki na podstawie poziomu lokalizacji SKN-1. Brak lokalizacji jądrowej, lokalizacja SKN-1B/C::GFP (Green Fluorescent Protein-tagowany SKN-1 izoforma B/C) w przedniej lub tylnej części robaka oraz lokalizacja jądrowa SKN-1B/C::GFP we wszystkich komórkach jelitowych są klasyfikowane odpowiednio na niski, średni i wysoki poziom lokalizacji.</li><li>Po ocenie mikrografów fluorescencyjnych określ różnice statystyczne za pomocą chi-kwadrat i dokładnych testów Fishera za pomocą oprogramowania statystycznego.</li></ol>

<table class='ck-table-resized'><tbody><tr><td>Nośniki i chemikalia</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>Bulion BD Bacto Todd Hewitt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td> </td></tr><tr><td>15 mL stożkowe rurki do wirówek sterylowych z polipropylenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td> </td></tr><tr><td>Azyd sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td> </td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetramilu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756</td><td> </td></tr><tr><td>Okładki nr 1.5 o wymiarach 18 mm x 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td> </td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539-50G</td><td> </td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td><td>Keith Blackwell</td></tr></tbody></table>

wizualizacja stresu oksydacyjnego wywołanego przez patogeny u c. elegans za pomocą skn-1 oznaczonego gfp

Źródło: <a href='https://app.jove.com/v/59301/studying-oxidative-stress-caused-mitis-group-streptococci'>Naji, A. i inni. Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce grupy Mitis u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)</a>Ten film demonstruje użycie zielonej, fluorescencyjnej białkowej oznakowanej SKN-1 w C. elegans do monitorowania stresu oksydacyjnego poprzez śledzenie zielonej fluorescencji. Robaki narażone na S. gordonii wykazują silną fluorescencję jądrową, potwierdzając stres wywołany patogenem, podczas gdy te karmione E. coli wykazują rozproszoną zieloną fluorescencję w cytoplazmie, co wskazuje na minimalną aktywację SKN-1.

Wizualizacja stresu oksydacyjnego wywołanego przez patogeny u C. elegans za pomocą SKN-1 oznaczonego GFP

Source: Naji, A., et al. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video ...

https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/24504/24504_article_thumb_24504.jpg

Zacznij od dwóch płytek zawierających robaki C. elegans , które wyrażają zielone fluorescencyjne białko oznaczone SKN-1, czynnikiem transkrypcyjnym zlokalizowanym w cytoplazmie jelitowej. Te robaki zawierają także granulki lipofucyny jelitowej, które wykazują autofluorescencję.Jedna płytka jest zasiewana bakteriami niepatogennymi jako grupą kontrolną, druga z bakteriami patogennymi jako grupą testową.W grupie testowej nadtlenek wodoru produkowany przez patogen wywołuje stres oksydacyjny, wywołując translokację SKN-1 do jąder jelit.W grupie kontrolnej większość SKN-1 pozostaje rozproszona w cytoplazmie.Każdą płytkę przemyj buforem i przełóż robaki do rurek.Wirówkuj, aby oddzielić robaki i usunąć bufor.Dodaj podłoże zawierające azyd sodu, aby je znieczulić.Zamontuj robaki na agarozowych podkładkach, załóż pokrywki i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj autofluorescencji, aby zwizualizować granice jądrowe.Silny sygnał jądrowy SKN-1 w teście, w porównaniu do rozproszonego sygnału cytoplazmatycznego w kontroli, wskazuje na relokalizację jądra i potwierdza stres oksydacyjny wywołany przez patogen.Za pomocą pipety dodaj około 100 larw L4 do każdej płytki THY z nasieniem streptococcus oraz NGM E. coli . Używaj trzech płytek na szczep bakterii.Inkubuj płytki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij płytki z inkubatora. Przemyj je M9W i zbierz robaki do stożkowych rurek o masie 15 mililitrów.Przemyj robaki trzy razy, tak jak wcześniej w fazie odśrodkowej. Usuń większość M9W przez aspirację. Do pelletu robaka dodaj 500 mikrolitrów M9W zawierającego 2 milimolarne azydy sodu lub chlorowodorek tetramilu do pelletu robaków do znieczulenia.Inkubuj rurkę z pelletami dżdżownicami w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie wrzuć 15 mikrolitrów zawiesiny z robaków na przygotowaną agarozową podkładkę. Pod mikroskopem fluorescencyjnym wizualizuj lokalizację SKN-1 za pomocą filtrów FITC i DAPI.Robaki obrazują się przy 10 razach i 20 powiększeniach. Oceniaj robaki na podstawie trzech poziomów lokalizacji; niskie lokalizacje, gdzie nie obserwuje się lokalizacji jądrowej, średnia lokalizacja, z SKN-1 BCGFP w przedniej lub tylnej części robaka, oraz wysoka lokalizacja, gdzie lokalizacja jądrowa SKN-1 BCGFP jest obserwowana we wszystkich komórkach jelitowych.

visualizing-pathogen-induced-oxidative-stress-c-elegans-using-gfp

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

Bacterial Pathogenesis and Host Interactions

bacterial-pathogenesis-and-host-interactions

Bacterial Virulence & Biofilms

Visualizing Pathogen-Induced Oxidative Stress in C. elegans Using GFP-Tagged SKN-1

71 Views. Zacznij od dwóch płytek zawierających robaki C. elegans , które wyrażają zielone fluorescencyjne białko oznaczone SKN-1, czynnikiem transkrypcyjnym zlokalizowanym w cytoplazmie jelitowej. Te robaki zawierają także granulki lipofucyny jelitowej, które wykazują autofluorescencję.Jedna płytka jest zasiewana bakteriami niepatogennymi jako grupą kontrolną, druga z bakteriami patogennymi jako grupą testową.W grupie testowej nadtlenek wodoru produkowany przez pa...

Wizualizacja stresu oksydacyjnego wywołanego przez patogeny u C. elegans za pomocą SKN-1 oznaczonego GFP

In This Article

Abstract

Protocol

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nośniki i chemikalia
Bulion BD Bacto Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
15 mL stożkowe rurki do wirówek sterylowych z polipropylenu	Fisher Scientific	12-565-269
Azyd sodu	Sigma Aldrich	S2002-25G
Chlorowodorek tetramilu	Sigma Aldrich	L9756
Okładki nr 1.5 o wymiarach 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell