Wizualizacja stresu oksydacyjnego wywołanego przez patogeny u C. elegans za pomocą SKN-1 oznaczonego GFP

Streszczenie

Źródło: Naji, A. i inni. Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce grupy Mitis u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje użycie zielonej, fluorescencyjnej białkowej oznakowanej SKN-1 w C. elegans do monitorowania stresu oksydacyjnego poprzez śledzenie zielonej fluorescencji. Robaki narażone na S. gordonii wykazują silną fluorescencję jądrową, potwierdzając stres wywołany patogenem, podczas gdy te karmione E. coli wykazują rozproszoną zieloną fluorescencję w cytoplazmie, co wskazuje na minimalną aktywację SKN-1.

Protokół

1. Obserwacja lokalizacji SKN-1 w odpowiedzi na zakażenie Streptococcus gordonii

1. Dodaj ~100 larw L4 do każdego ekstraktu drożdżowego Todd–Hewitt (THY) zasianego Streptococcus oraz do każdej płytki agarowej na podłożu nicieni (NGM) z nasionami Escherichia coli (E. coli). Używaj trzech płytek na szczep bakterii. Inkubuj płytki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 25 °C.
2. Następnie wyjmować płytki z inkubatora, przemyć je zmodyfikowanym buforem M9 (M9W) i zebrać robaki w stożkowych tubkach o pojemności 15 mL.
3. Umyj robaki 3 razy.
4. Usuwa większość M9W przez aspirację i dodaje 500 μL M9W zawierającego 2 mM azydu sodu lub 2 mM chlorowodorku tetramilu do pelletu robaka. To znieczuli robaki, zapewniając, że podczas badania pod mikroskopem nie dochodzi do żadnego ruchu.
   UWAGA: Używaj środków ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z azydem sodu. Przygotuj roztwór azydu pod chemiczną pokrywą.
5. Inkubuj granulki robaków w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut. Następnie umieść 15 μL zawiesziny robaka na przygotowanej agarozowej podkładce. Delikatnie nałóż pokrywkę nr 1.5 na agarozową poduszkę zawierającą znieczulone robaki.
6. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zwizualizuj lokalizację czynnika transkrypcyjnego rodziny Skinheadów 1, czyli SKN-1:GFP (SKN-1 oznaczonego Green Fluorescent Protein-tag), wykorzystując izotiocjanian fluoresceiny (FITC) oraz filtry 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI). Robaki obrazowe przy powiększeniach 10x i 20x.
7. Oceniaj robaki na podstawie poziomu lokalizacji SKN-1. Brak lokalizacji jądrowej, lokalizacja SKN-1B/C::GFP (Green Fluorescent Protein-tagowany SKN-1 izoforma B/C) w przedniej lub tylnej części robaka oraz lokalizacja jądrowa SKN-1B/C::GFP we wszystkich komórkach jelitowych są klasyfikowane odpowiednio na niski, średni i wysoki poziom lokalizacji.
8. Po ocenie mikrografów fluorescencyjnych określ różnice statystyczne za pomocą chi-kwadrat i dokładnych testów Fishera za pomocą oprogramowania statystycznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nośniki i chemikalia
Bulion BD Bacto Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
15 mL stożkowe rurki do wirówek sterylowych z polipropylenu	Fisher Scientific	12-565-269
Azyd sodu	Sigma Aldrich	S2002-25G
Chlorowodorek tetramilu	Sigma Aldrich	L9756
Okładki nr 1.5 o wymiarach 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell