Przygotowanie modelu aspiracji orofarygealnej u myszy w celu wykrycia bakteryjnych infekcji płuc

Streszczenie

Źródło: Nielsen, T. B. i in., Model aspiracji orofaryngealnej myszy bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje procedurę dostarczania bakterii przez gardło do płuc znieczulonej myszy, aby wywołać infekcję płuc i wywołać odpowiedź immunologiczną.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Szczepienie/zakażanie myszy

1. Zawiesz znieczuloną mysz, zawieszając ją na górnych siekaczach na mocnym, cienkim sznurku (np. nici dentystycznej) przymocowanym do stałego przedmiotu na wysokości około dwukrotności długości ciała myszy (np. 20 cm) nad powierzchnią operacyjną (np. stoł laboratoryjny).
2. Delikatnie wyciągnij język myszy z ust, używając sterylnych, tępych kleszczy. Przenieś język na sterylny, rękawiczkowany palec, aby zapobiec przypadkowemu zmiażdżeniu języka myszy. Trzymaj język poza jamą ustną, umożliwiając dostęp do gardła i zapobiegając połykowaniu inokulum na bok.
3. Trzymając język myszy, umieść inokulum 50 μL (zawiesina bakteryjną) do gardła za pomocą mikropipety; Orofarynx znajduje się na styku jamy ustnej i gardła z tyłu jamy ustnej.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dostarczać płyn tylko przez pipetowanie do pierwszego przystanku mikropipety. Mysz przestaje oddychać na kilka sekund, gdy inokulum zostanie umieszczone w oroforynsie; Ostatecznie odruchowe zachłanianie powoduje u myszy wdychanie zawiesiny bakteryjnej, co potwierdza charakterystyczny trzask płynu wnikającego do płuc, co prowadzi do zakażenia zapaleniem płuc.
4. Jeśli inokulum nie jest umieszczone wystarczająco daleko, by zablokować prawidłowe oddychanie, ściśnij nos kleszczami, aby wymusić odruchowe zadychanie przez usta i późniejsze wdychanie inokulum.
5. Po zaszczepieniu zwolnij język, wyjmij mysz ze sznurka wiszącego, umieść ją w klatce i obserwuj, aż się obudzi z znieczulenia.

2. Monitorowanie postępu choroby

UWAGA: Ze względu na cierpienie zwierząt należy stosować różne wskaźniki, aby wskazać, kiedy myszy stają się martwe; eutanazja powinna być przeprowadzona po tej decyzji, zgodnie z wcześniej zatwierdzonym protokołem IACUC; Różne markery moribundity to temperatura ciała, utrata masy ciała, wygląd, chód oraz inne biomarkery, które można uzyskać z krwi (np. za pomocą iSTAT).

1. Uśpić myszy zgodnie z wcześniej zatwierdzonym protokołem IACUC (np._CO2 , a następnie zwichnięciem szyjki macicy).
2. Usunięcie płuc z uśpionej myszy poprzez przecięcie tchawicy, tętnicy płucnej i żyły płucnej blisko płuc.
   1. Mikroskopia
      1. Umieść płuca (lub jego część) w formie próbki.
      2. Napełnij formę preparatu preparatem do stosowania preparatu do stosowania preparatu o temperaturze optymalnej temperatury cięcia (O.C.T.), całkowicie zanurzając tkankę.
      3. Zamroź próbkę w temperaturze -80 °C.
      4. Wyślij próbkę do laboratorium patologicznego na cięcie i zamontowanie szkiełek do mikroskopii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komora do znieczulenia	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	Mieszczą do 5 myszy
Kriomold, rozmiar średni	Sakura Tissue-Tek	4566	Jednorazowe formy do próbek winylowych, 15×15×5 mm
Nić dentystyczna	Oral-B	37000469537	Przywiązuj do słupka stajni, około 6" powyżej stołu
Kleszcze	VWR	82027-440	Używa się do delikatnego wyciągania języka z pyska myszy
Izofluran do znieczulenia	Abbott	10015516	Można stosować leki alternatywne; odpowiednio zmodyfikuj procedurę
Wkład iSTAT	Abbott	03P79-25	Dostępne są różne wkłady dostosowane do Twoich potrzeb
Ketamina, 100 mg/mL	Zaopatrzenie Medyczne Zachodnie	4165	Rozcieńcz 1:10 w PBS do 1 mg/mL i połącz z ksylazyną w dawce 1 mg/mL
Maść na oczy	Akorn	Łzy odnowione	Unikaj dotykania oka końcówką dozownika
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Corning	21-031-CM	PBS Dulbecco bez wapnia i magnezu
Końcówki pipety, 200-μL	VWR	10017-044	Autoklawuj przed użyciem
Pifleter, 200-μL	Gilson	Pipetman P200	Autoklawuj i kalibruj przed użyciem
Rozpylacz i komórka bakteryjna	Bel-Art	F377360006	Sterylizuj przez pieczenie lub autoclaw przed każdym użyciem
Fiolka, kriogeniczna, 2,0 mL	Corning	430659	Wykorzystywane do kriogenicznego magazynowania skoncentrowanych bakteryjnych inokuli