Aktywacja światłem biofilmów bakteryjnych z użyciem prekursora fotosensywnego

Streszczenie

Źródło: Zhao, K. i in. Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej pośredniczonej kwasem 5-aminolewulinowym na biofilm gronkowca aureus . J. Vis. Exp. (2018)

Film prezentuje protokół terapii fotodynamicznej mający na celu ocenę działania antybakteryjnego na biofilmy bakterii Gram-dodatnie. Biofilmy dzielą się na cztery grupy: dwie otrzymują prekursor fotosensyzatora, a dwie otrzymują bufor. Wszystkie są inkubowane w ciemności, po czym następuje ekspozycja na czerwone światło dla jednej grupy poddawanej prekursorom i jednej grupie tylko buforowej. Reaktywne formy tlenu powstają tylko w grupie otrzymującej zarówno prekursor, jak i światło, co prowadzi do śmierci komórek bakteryjnych. Wskaźniki żywotności są porównywane we wszystkich grupach w celu oceny skuteczności leczenia.

Protokół

1. Formowanie biofilmu

1. Formowanie biofilmu w mikropłytkach 96-dołkowych
   1. Pobierz szczep Staphylococcus aureus USA300 oraz 3 szczepy kliniczne tworzące biofilm (C1-C3) przechowywane w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Zdolność szczepów klinicznych do tworzenia biofilmów została określona na podstawie testu mikromiareczkowego.
   2. Zaszczepić bakterię w podłożu z trusionu sojowego (TSB) o pojemności 5 mL i uprawiać w inkubatorze, potrząsając w 37 °C przez noc aż do fazy stacjonarnej.
   3. Nawigać nocną hodowlę bakteryjną w dawce 4 000 × g przez 10 minut w 25 °C i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesij pellety w soli fosforanowej (PBS) do końcowego stężenia 2,0 × 10,9 jednostek kolonii (CFU)/mL.
      UWAGA: Stężenie bakterii oszacowano na podstawie pomiaru gęstości optycznej, a następnie na podstawie liczby płytek, co wykazało, że 1 OD₆₀₀ zawiesiny zawierało 1,5 ×^10,8 CFU/mL.
   4. Rozcieńcz zawiesinę bakteryjną do 1:200 (1,0 × 10,7 CFU/mL) w podłożu TSB zawierającym 0,5% glukozy. Zaszczepić 200 μL zawiesiny bakteryjnej do każdego dołku mikropłytki polistyrenowej o 96 dołkach obtraktowanej hodowlą komórkową.
   5. Mikropłytkę inkubuj statycznie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w dobrze natlenionym środowisku.
      UWAGA: Czas inkubacji dojrzałego biofilmu może się różnić w zależności od szczepów bakterii; powinno to zostać określone przed eksperymentem Terapii Fotodynamicznej (PDT).
   6. Usuń medium do dołków i delikatnie przemyj mikropłytki PBS trzy razy, a następnie wyrzuć supernatant.
      UWAGA: Etap ten powinien być wykonywany bardzo delikatnie, aby nie zakłócić powstałego biofilmu.

2. Promieniowanie świetlne

1. Przechowuj kwas 5-aminolewulinowy (5-ALA) w lodówce o temperaturze 4 °C. Przed eksperymentem rozcieńcz 5-ALA za pomocą PBS do 10 mM.
   UWAGA: Roztwór 5-ALA powinien być przygotowany świeżo przed eksperymentem.
2. W grupie eksperymentalnej należy dodać 200 μL 10 mM ALA do każdej dołki mikropłyty lub 2 mL do naczynia hodowlanego. Przykryj talerz/miskę folią aluminiową i inkubuj przez godzinę. Następnie napromieniuj płytę/antenę diodą LED o natężeniu światła 100 mW/^{cm 2} przez godzinę, aby uzyskać dawkę światła 360 J/^cm2 przy długości fali głównej 633 ± 10 nm.
   UWAGA: Aby energia światła była skutecznie i równomiernie dostarczana do biofilmu we wszystkich studniach/naczyniach, ustalić odległość od szczytu źródła światła do doły/talerza na 6,0 cm i ograniczyć obszar eksperymentalny do centralnego obszaru napromieniowania (10 cm × 8 cm). Aby zapewnić powtarzalność wyników, eksperymenty powinny być przeprowadzane w tej samej temperaturze pokojowej. W etapie napromieniowania LED, aby uniknąć bezpośredniego narażenia płyty na inne źródła światła, takie jak światło słoneczne, oświetlenie pokoju czy lampa, dioda LED była włączana przed przeniesieniem talerza do obszaru napromieniowania, a światło było na tyle jasne, by dokończyć operację.
3. Ustalili grupy kontrolne (w naszym eksperymencie utworzono trzy grupy kontrolne).
   1. Dla pierwszej grupy kontrolnej (ALA-LED-) należy dodać 200 μL PBS do każdej dołki mikropłyty lub 2 mL do naczynia hodowlanego. Przykryj talerz/miskę folią aluminiową i inkubuj przez 2 godziny.
   2. Dla drugiej grupy kontrolnej (ALA+LED-) należy dodać 200 μL 10 mM ALA do każdego dołka mikropłytki lub 2 mL do naczynia hodowlanego. Przykryj talerz/miskę folią aluminiową i inkubuj przez 2 godziny.
   3. Dla trzeciej grupy kontrolnej (ALA-LED+) dodaj 200 μL PBS do każdego dołka mikropłyty lub 2 mL do talerza hodowlanego. Przykryj talerz/talerz folią aluminiową i inkubuj przez godzinę. Następnie naświetl płytę na światło LED o częstotliwości 360 J/^{cm 2} o długości fali głównej 633 ± 10 nm.
      UWAGA: W etapie napromieniowania LED unikaj bezpośredniego narażania płyty na inne źródła światła, takie jak światło słoneczne, oświetlenie pomieszczenia czy lampa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion sojowy tryptonowy (TSB)	OKSOID	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	Zestawy do aktywności bakterii LIVE/DEAD BacLight
Jodku propidium (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	Zestawy do aktywności bakterii LIVE/DEAD BacLight
5-aminolewulinowy kwas (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Pharm	3.1
Szczep Staphylococcus aureus USA300			Odniesienia do USA 300
Szczepy kliniczne gronkowca aureusa (C1-C3)			Wszystkie szczepy kliniczne zostały wyizolowane od pacjentów z przewlekłym zapaleniem zatok nosowych
Mikropłytka 96-dołkowa	Corning Inc	3599	Przezroczyste mikropłytki z polistyrenem TC impregnowane płaskospodnie, indywidualnie owinięte, z pokrywką, sterylne
Mikrowirówka Eppendorfa 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Inkubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	Orbitalne shakery MaxQ 4000
Dioda LED	Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO	LED-IB