Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Streszczenie

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących fluorescencyjne białko, aby unieruchomić komórki. Następnie ramka jest uszczelniana pokrywką i obserwowana pod mikroskopem, aby uchwycić obrazy fluorescencji bakterii.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury związane z wzrostem, manipulacją i obrazowaniem L. pneumophila powinny być wykonywane w laboratorium biologicznego poziomu 2 w zakresie bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z lokalnymi wytycznymi.

1. Wprowadzenie sfGFP do chromosomu Legionella pneumophila z wykorzystaniem strategii wymiany allelowej i podwójnego wyboru (Rysunek 1, Rysunek 2)

1. Sklonuj do wektora zastępującego geny pSR47S11 następującą sekwencję: 1000 bp przed interesującym miejscem, następnie sekwencję sfGFP, a następnie 1000 bp poniżej interesującego miejsca (Rysunek 1). Sekwencja sfGFP powinna być umieszczona w ramce względem końca N lub końca C, z łącznikiem zawierającym od czterech do ośmiu aminokwasów. Przekształc powstały wektor w Escherichia coli DH5αλpir. Później L . pneumophila (odbiorca) tworzy pojedyncze kolonie na agarze z ekstraktem drożdży drzewnych (CYE) zawierającym 100 μg/mL streptomycyny i rośnie przez 5 dni w temperaturze 37 °C (Rysunek 2).
2. Rozprowadź L. pneumophila na CYE-agar-streptomycynie i rosnąć przez 2 dni w temperaturze 37 °C (gęsta plama). Streak E. coli DH5α przekształcony z pRK600 pomocniczym plazmidem (pomocniczym) na agarze LB zawierającym 25 μg/mL chloramfenikol. Na agarze LB zawierającym 50 μg/mL kanamycynę nanieś E. coli DH5αλpir (dawcę).
3. Przeprowadz trójrodzicielskie kopulację: wysiaduj kolonię pomocnika, kolonię dawcy oraz biorcę, nakładając fragmenty trzech szczepów na płytkę agarową CYE bez selekcji i wysiabując przez 4–8 godzin w temperaturze 37 °C. Jako kontrolę negatywną inkubuj mieszankę szczepu pomocniczego+biorca oraz mieszankę szczepu dawca+biorca przez ten sam okres czasu.
4. Ponownie zawiesić reakcje kojarzenia w 500 μL ddH2_O. Płyta 20 μL i 50 μL reakcji na agarze CYE zawierającym 100 μg/mL streptomycyny i 10 μg/mL kanamycyny i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Cztery powstałe klony napasować na agarze CYE zawierającym 100 μg/mL streptomycyny i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 37 °C.
5. Streak 16 klonów na agarze CYE zawierających 5% sacharozy i 100 μg/mL streptomycyny i rośnie przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Następnie nałoż 32 takie klony na agar CYE zawierający 100 μg/mL streptomycynę oraz na agar CYE zawierający 100 μg/mL streptomycyny i 10 μg/mL kanamycyny i rosną przez 5 dni w temperaturze 37 °C.

2. Izolacja klonów, które zintegrowały sfGFP z chromosomem L. pneumophila

1. Klony smug wrażliwe na kanamycynę na płytach CYE-agar-streptomycyny potwierdzają wszczepienie sfGFP do chromosomu w reakcji łańcuchowej polimerazy kolonii (PCR). Użyj primerów komplementarnych do genu sfGFP oraz do interesującego obszaru chromosomowego, aby wzmocnić złącze insercyjne.
   1. Wymieszaj 0,5 μL każdego z roztworów 10 μM i jednej kolonii do końcowej objętości 12,5 μL i denaturuj przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Schłodz na lodzie przez 10 minut, dodaj 12,5 μL 2x roztworu PCR master mix i wykonaj analizę PCR.
2. Hodować gęste fragmenty izolowanych kolonii na płytkach CYE-agar-streptomycyny przez 2 dni w temperaturze 37 °C. Zbadać poziomy ekspresji i stabilność fuzji sfGFP poprzez immunobbloting przeciwciałem anty-GFP.

3. Obrazowanie żywymi komórkami L. pneumophila z fluorescencyjnie oznakowanymi komponentami kropkowymi/icm

1. Przygotowanie agarozowych podkładów
   1. Przygotuj około 30 ml 1% roztworu agarozy o niskim stężeniu stopienia w wodzie. Podgrzewaj mikrofalówkę w szklanej kolbie przez około 90 sekund, czasem mieszając, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
   2. Umieść dwa szkiełki 22 x 22 x 0,15^{mm 3} szklane na krawędzi szkiełka 25 x 75 x 1,1^{mm 3} szklane, jeden na drugim. Na drugiej krawędzi ułóż jeszcze dwa kolejne szkiełki 22 x 22 x 0,15 mm z³ szklanymi szkiełkami.
   3. Pipetą włóż około 1 ml stopionej agarozy do środka między dwoma górnymi szkiełkami, a następnie umieść kolejną szkiełkę o wymiarach 25 x 75 x 1,1 mm³ na górę stopionej agarozy. Staraj się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Schładz zlewki w 4 °C przez 15 minut.
   4. Używając skalpela lub żyletki, delikatnie wytnij podkładkę na małe kwadraty, ~5 x 5^{mm 2}. Przymocuj dwustronną ramkę klejową 17 x 28 x 0,25 mm³ na szkiełce 3 o wymiarach 25 x 75 x 1,1^{mm i} umieść kilka padów na prowokacji.
2. Akwizycja obrazu
   UWAGA: Opisane są następujące kroki dla mikroskopu kontrolowanego przez SlideBook 6.0 i wyposażonego w iluminatory półprzewodnikowe, kamerę monochromatyczną CCD oraz obiektyw 100x (przysłona numeryczna 1,4). W razie potrzeby używaj alternatywnych urządzeń mikroskopowych z odpowiednimi konfiguracjami sprzętowymi i programowymi, które można dostosować do ustawień protokołu.
   1. Rozpuszcz gęsty fragment L. pneumophila w 1 mL ddH2_O, wiruj i pipetuj 2–3 μL rozcieńczenia na podkładki. Delikatnie przyłóż na samolepą ramkę o wymiarach 50 x 24 x 0,15 mm³ .
   2. W oknie przechwytywania dostosuj ND do 180. Sreguluj binowanie na 2×2 i użyj kanału 488 nm, aby naświetlić próbkę w odległości od 500 do 1000 ms. Zweryfikować specyficzność sygnału fluorescencyjnego, obrazując nieoznakowane L. pneumophila z tymi samymi parametrami (Rysunek 3).

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny przegląd homolognej rekombinacji i wymiany allelowej używanej do wszczepienia sfGFP do chromosomu L. pneumophila.(A) Trójrodzicielskie parowanie przeprowadzono pomiędzy szczepem p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100x cel Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Węgiel aktywny	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroza GPG/LMP, niskostopienkowa	Amerykańska bioanalityczna	AB00981
Bacto odwodniony agar	BD	214010
Rama genowa, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
L-cysteina	Sigma-Aldrich	C7352
Szkiełka osłonowe mikroskopu 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Szkiełka oklopowe mikroskopu 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Szkiełka mikroskopowe 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Innowacje w inteligentnym obrazowaniu
Lekki silnik Spectra X	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Tytan Krios	Thermo Fisher Scientific
Ekstrakt drożdżowy	BD	212750