$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
- Pozyskiwanie próbek do enumeracji Clostridium difficile (C. difficile)
UWAGA: Przed uzyskaniem kału lub zawartości cekalu, waż sterylne rurki mikrowirówki na wadze analitycznej. Zapisz masę lampy na boku lampy, zaokrąglając do czterech miejsc po przecinku (np. 0,9864 g). Oznacz tę masę jako "ciężar rury". Każda pobrana próbka powinna być umieszczona w sterylnej, ważonej probówce mikrowirówki.
1. Sterylne zbieranie odchodów myszy- Delikatnie unieruchom każdą mysz, chwytając zwierzę za luźną skórę szyi i pleców, aby unieruchomić głowę. Użyj małego palca, aby delikatnie unieruchomić ogon zwierzęcia, odsłaniając tym samym odbyt. Upewnij się, że zwierzę nie wydaje dźwięków ani nie wykazuje innych oznak stresu podczas unieruchamiania.
- Trzymaj sterylną, ważoną rurkę mikrowirówki bezpośrednio pod odbytem zwierzęcia. Niezbędne jest, aby rurka nie miała bezpośredniego kontaktu z myszą.
- Podczas gdy zwierzę wypróżnia się, zbieraj granulki kałowe do rurki. Utrzymuj probówkę w temperaturze pokojowej, dopóki nie zostaną pobrane wszystkie próbki kału. Usunięcie się może zająć kilka minut, co wymaga wielokrotnych prób zbierania odchodów.
- Waż rurki zawierające kał na wadze analitycznej. Zapisz wagę lampy, zaokrąglając do czterech miejsc po przecinku (np. 1,0021 g). Oznacz uzyskaną masę jako "ostateczną masę lampy".
- Próbki kału należy przepuścić do komory beztlenowej w celu wyliczenia bakterii bezpośrednio po pobraniu stolca.
- Enumeracja bakteryjna C. difficile
- Oblicz ostateczną wagę zawartości (kałów), które zostaną wyliczone dla C. difficile. Wykonałem to, odejmując "ostateczną wagę rury" od "wagi rury".
- Oblicz rozcieńczenie zawartości w proporcji 1:10 do 1X soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i odpowiednio zawiesinuj. W przypadku granulek kałowych użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozbić granulat do roztworu.
- Beztlenowo inkubuj te ponownie zawieszone próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, pozwalając zawartości się osadzić.
- Wykonuj rozcieńczenia seryjne dla każdej próbki w 1x PBS do wyliczania jednostek tworzących kolonie (CFU) na g zawartości (kał). Wykonaj to beztlenowo.
- Stosując technikę aseptyczną, przenieś 100 μl każdej seryjnej rozcieńczenia na płytki taurochololu cykoloryzyny cefoktytyny fruktozowo-agarowej (TCCFA). Używając sterylnego rozprowadzacza w kształcie litery L, rozprowadził rozcieńczenie nałożone na podłoże, aby równomiernie rozprowadzić je na całej płycie. Nawet rozprzestrzenianie się rozcieńczenia jest niezbędne do dokładnego wyliczania kolonii.
- Inkubuj płytki beztlenowo przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. W tym czasie należy wyliczyć kolonie C. difficile , aby uzyskać CFU per g zawartości (kału). Kolonie C. difficile są płaskie i bladożółte, mają nieregularne krawędzie i wygląd szkła mielnego.
UWAGA: Protokół ten może być używany do wyróżniania C. difficile od innych zawartości układu pokarmowego (GI) u myszy, w tym zawartości jelita brzędowego i okrężnego. Płytki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mogą być używane do produkcji seryjnych rozcieńczeń.