Test fluorescencyjny do badania interakcji receptorów makrofagów z antygenami bakteryjnymi

Streszczenie

Źródło: Barbero, A. M., et.al. Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem odpornościowym SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)

Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji badający interakcję między receptorem makrofagów a antygenami Mycobacterium tuberculosis . Antygeny znakowane fluorescencją na slipie są inkubowane z ekstraktami białek makrofagów, sieciowane, znakowane przeciwciałami i wizualizowane przez nakładające się sygnały fluorescencji.

Protokół

1. Interakcja Mycobacterium tuberculosis z SLAMF1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Sieciowanie bakterii i białek
   1. Wprowadź 12 mm okrągłe pokrywki do płytek hodowlowych z 24 dołkami (1 pokrywka na dołek) za pomocą chirurgicznych pęsety o okrągłym nosku.
      UWAGA: Dokładnie wyczyść pokrywy z 70% etanolem. Jeśli chcesz, można je poddać autoklawowi lub wysterylizować pod światłem UV przez 30 minut.
   2. Inkubuj pokrywkę 400 μL poli-D-Lizyny o pojemności 10 μg/mL przez noc w temperaturze 4 °C. Okryj płytę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
   3. Następnego dnia wyjmij talerz z lodówki i umyj pokrywkę dwukrotnie 1 mL wody.
   4. Pozwól, by slip wyschnął.
   5. Rozcieńcz 20 μL (2 x 10⁶) Mtb-R Ags w 180 μL 1x PBS. Ostatnie 200 μL wystarcza, aby całkowicie pokryć slip pokrywający.
   6. Inkubuj pokrywkę z Mtb-R Ags przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym.
   7. Usuń pozostałą ilość płynu i przepłucz dwukrotnie 1 mL 1 ml PBS (soli fizjologicznej z buforem fosforanow).
      UWAGA: W tym etapie prawidłową przyczepność Mtb-R do pokrywy można sprawdzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając filtrów odpowiadających czerwonemu kanałowi.
   8. Dodaj 400 μL buforu blokującego (10% surowicy płodowej bydła (FBS)) w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 30 minut w stanie RT w mieszanicy.
   9. Przemyj dwa razy 400 μL bufora blokującego.
   10. Inkubować z 100 μL ekstraktu białkowego rozcieńczonego w 300 μL 1x PBS przez 2 godziny w RT w mieszaniku (shakerze).
   11. Dodaj 400 μL 1% rozcieńczonego dehydu w 1x PBS. Inkubuj przez 15 minut pod poruszeniem (shakerem) w RT.
   12. Dodaj 500 μL glicyny 0,125 M rozcieńczonej w wodzie. Inkubuj przez 5 minut pod poruszeniem (shakerem) w RT.
   13. Pierz dwa razy z 1 mL 1x PBS.
   14. Dodaj 400 μL 2 mM glikolu etylenowego bis(sukcinimidylsukcynian) (EGS) przez 1 godzinę w RT w mieszaniu (shakerze).
   15. Powtórz krok 1.1.13
       UWAGA: Zaleca się przygotowanie odczynników w momencie użycia.
2. Barwienie SLAMF1
   1. Owiń pokrywkę talerza z hodowlą w folię parafinową.
   2. Na pokrywkę pokrytą folią parafinową dodaj kroplę 60 μL wcześniej dozowanego pierwotnego przeciwciała anty-SLAMF1 (rozcieńczenie 1:75).
   3. Ostrożnie zdejmij pokrywkę z płytki za pomocą zakrzywionych, cienkokońcowych chirurgicznych pęsety i igieł.
      UWAGA: Aby ułatwić usuwanie pokrywek, igła może być wygięta pod kątem około 45°.
   4. Odwróć slip na kroplę zawierającą przeciwciało. Inkubuj przez 30 minut w RT w ciemności.
   5. Podnieś slip i przemyj dwa razy za pomocą bufora blokującego.
   6. Odwróć pokrywkę na nową kroplę zawierającą przeciwciało wtórne (rozcieńczenie 1:200). Inkubuj przez 30 minut w RT w ciemności.
   7. Powtórz krok 1.2.5.
   8. Usuń nadmiar płynu i zamontuj pokrywkę na kropli płynu montującego na szklanym szkiełku.
   9. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów.
      UWAGA: Zalecana jest praca w warunkach sterylnych. Rozcieńcz przeciwciała w buforze blokującym. Ostrożnie obchodz się z okładką, aby uniknąć zarysowań, które mogą utrudniać obserwację pod mikroskopem. Gorąco zaleca się stosowanie płynu do nabierania odpowiedniego do fluorescencji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21121	Do mikroskopii fluorescencyjnej
Przeciwciało podstawowe przeciwciało przeciw SLAMF1	BioLegend	306302	Do mikroskopii fluorescencyjnej
Aqua-Poly/Montaż	Nauki polinaukowe	18606-20	Nośniki montażowe
Pokrywki 12mm	HDA	-	Do analizy interakcji za pomocą mikroskopii
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Do leczenia sieciowania
Formaldehyd	Merck	K47740803613	Do leczenia sieciowania
Szklane slajdy	Glass Klass	-	Do analizy interakcji za pomocą mikroskopii
Glycine	Sigma	G8898	Do leczenia sieciowania
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Mikroskop fluorescencyjny z modułem oświetlenia Colibri 7
Poli-D-Lizyna	Sigma Aldrich	A-003-M	Do leczenia pokrywek
Rodamina B	Sigma Aldrich	21955	Dla M. Zabarwienie gruźlicą