Opracowanie modelu infekcji larw danio pręgowanego z wykorzystaniem mikrogawage

Streszczenie

Źródło: Li, J. i inni. Opracowanie modelu infekcji larwal danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje procedurę mikrogavage, w której znieczulona larwa danio jest unieruchomiona w agarozie i doustnie wstrzykiwana patogenną bakterią za pomocą igły prowadzonej przez śledzenie. Nieinwazyjne podanie naśladuje naturalne zakażenie, umożliwiając analizę replikacji bakterii, uwalniania toksyn oraz uszkodzeń nabłonka jelit.

Protokół

1. Gavage larw pręgowanego pręgowanego

1. Skalibruj igłę mikrogavage.
2. Zmierz średnicę końcówki igły, umieszczając igłę na szkiełku kalibracyjnym z jedną kroplą oleju mineralnego. Upewnij się, że końcówka ma średnicę 30–40 μm, jest tępa i gładka. Usuń ostre lub szorstkie igły.
   UWAGA: Ostre krawędzie igieł można stępić szybkim płomieniem.
3. Przygotuj roztwór gavage.
4. Załaduj i zamontuj igłę na mikromanipulatorze.
5. Ustawij mikromanipulator tak, aby ustawił igłę pod kątem 45°.
6. Znieczulaj larwy danio pręgowanego. Gdy larwy przestają się poruszać, przenieś je do rowka formy mikrogavage za pomocą pipety Pasteura.
7. Na larwy danio dano nałóż kroplę 0,8% niskotopniejącej agarozy, aby ją przykryć. Delikatnie ustawiaj larwy z głowami skierowanymi pionowo pod kątem 45° w rowku i ogonami przylegającymi do ściany rowka. Upewnij się, że kąty główek są mniej więcej takie same, tak aby były wyrównane z kątem igieł gavage. Umieść formę mikrogavage na lodzie na 30–60 sekund, pozwalając niskotopniejącej agarozie stwardnieć i ustabilizować pozycję larw.
8. Reguluj ciśnienie wtrysku w zakresie 200–300 hPa. Ustaw czas wstrzyknięcia na 0,1–0,3 s, aby uzyskać objętość wtrysku 3–5 nL Clostridioides difficile.
9. Delikatnie przeprowadź igłą przez agarozę, następnie do pyska larw danio pręgowanego i przez przełyk. Gdy czubek igły znajduje się wewnątrz przedniej opaski jelita, naciśnij pedał wstrzykiwania, aby uwolnić bakterie. Napełnij światło jelita dostarczoną objętością. Nie pozwól, by przelew się z przełyku lub kloaki. Delikatnie wyciągnij igłę z pyska danio pręgowanego.
10. Po odcięciu uratuj zainfekowane larwy danio pręgowanego przed agarozą za pomocą elastycznego mikroładownika, najpierw odcinając agarozę, a następnie podnosząc larwy. Przenieś te larwy do sterylnego 30% podłoża Danieau. Przepłucz larwy dwukrotnie w sterylnym medium. Przenieś larwy do świeżej 10-cm szalki Petriego. Larwy będą utrzymywane do 11 dni po zapłodnieniu (dpf).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-nisko żelująca agaroza
Agaroza niskotopniąca (LM)	Pronadisa	8050	Stosuje się go w płytach agarozowych
Szkło kapilarne	Aparat Harvarda	30-0019	Igły do wstrzykiwania
Clostridioides difficile			R20291, szczep ribotypu 027, produkcja TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIDŻI	Platforma open-source		Przetwarzanie obrazu
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Pozioma wyciągarka igieł	Sutter instrument Inc	P-87
L-cysteina	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Przetwarzanie obrazu
Mikrowtryskiwacz	Eppendorf	5253000017
Formy mikrowtryskowe	Narzędzia Nauki Adaptacyjnej	TU1
Mikroskop konfokalny Leica SP8	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Chlorek potasu (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Chlorek sodu (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholat	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Ekstrakt drożdżowy	BD Bacto	212750