Szczepienie patogena bakteryjnego do liści Arabidopsis poprzez infiltrację próżniową

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Rufián, J. S., et.al. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje metodę infiltracji próżniowej polegającą na wprowadzeniu patogenu bakteryjnego do liści rośliny Arabidopsis . Podejście to wykorzystuje przygotowaną zawiesinę bakteryjną oraz impulsy próżniowe, aby umożliwić równomierne przenikanie przez szparki szparkowe, co skutkuje kontrolowanym zakażeniem liści.

Protokół

1. Inokulacja roślin Arabidopsis

UWAGA: W tym badaniu szczepy Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 i P. syringae pv. stosowano phaseolicola 1448A.

Przygotuj szczepionkę P. syringae .
1. Rozproszyć interesujący szczep P. syringae z zapasu glicerolu o temperaturze −80 °C na płytkę LB (10 g/l tryptonu, 5 g/L NaCl, 5 g/L ekstraktu drożdżowego i 16 g/L agaru bakteriologicznego) uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 40-48 godzin.
  UWAGA: Zaleca się stosowanie antybiotyków, jeśli interesujący szczep zawiera plazmid lub gen oporności genomowej. Zalecane stężenia antybiotyków dla P. syringae są następujące: kanamycyna (15 μg/mL), gentamycyna (10 μg/mL), ampicylina (300 μg/mL).
2. Wyskrobaj biomasę bakteryjną i zawiesz ją ponownie w 5 mL 10 mM MgCl₂. Zmierz OD₆₀₀ i dostosuj do 0,1, dodając 10 mM MgCl₂.
  UWAGA: OD₆₀₀ 0,1 hodowli P. syringae odpowiada 5 x 10⁷CFU·mL⁻¹.
3. Wykonaj serialne rozcieńczenia do 10 mM MgCl₂ , aby uzyskać końcowe stężenie inokulum 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Przygotuj 200 ml inokulum dla roślin Arabidopsis .
4. Tuż przed szczepieniem dodaj surfaktant Silwett L-77 do końcowego stężenia 0,01% Arabidopsis. Należy zauważyć, że Silwett jest nieco szkodliwy dla tkanki Arabidopsis.
Wykonaj infiltrację próżniową.
1. Dla infiltracji Arabidopsis, umieść dwa drewniane patyki tworzące X nad garnkiem (rysunek 1E) i postaw naczynie skierowane do dołu nad szalką Petriego o średnicy 14 cm zawierającą inokulum 200 mL (rysunek 1F).
2. Umieść rośliny zanurzone w roztworze inokulum do komory próżniowej (rysunek 1G) i podaj impuls 500 mbar przez 30 sekund, aby przeniknąć do liści. Powtórz impuls próżniowy 2-3 razy, aż liść zostanie całkowicie przeniknięty (rysunek 1H).
3. Odcedź nadmiar roztworu inokulum kartką papieru i odłóż rośliny do odpowiedniej komory wzrostu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Szczepienie bakteryjne i ekstrakcja apoplastów z użyciem roślin Arabidopsis . (A) Przygotowanie garnka z prawidłowo przymocowaną metalową siatką. (B) Siew nasion za pomocą wykałaczki do i...