Wysokoprzepustowe obrazowanie wewnątrzkomórkowego zakażenia brucella abortus w komórkach nabłonka gospodarza

Streszczenie

Źródło: Casanova, A. i in. Testy oparte na mikroskopii do wysokoprzepustowego przesiewania czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję brucella komórkami hela. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje wysokoprzepustowe obrazowanie zakażenia Brucella abortus w komórkach nabłonkowych z użyciem siRNA-medializowanego STING knockdown, aby zbadać rolę wykrywania DNA cytosolowego w wewnątrzkomórkowej replikacji bakterii oraz wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Protokół

1. Zakażenie i fiksacja

1. Dzień przed zakażeniem zaszczepić ustaloną ilość hodowli startowej B. abortus w podłożu 50 ml TSB/km (tryptyczny bulion sojowy zawierający 50 μg/ml kanamycyny) w butelce z nakrętką 250 ml. Butelkę zabezpiecz Parafilmem i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 °C i 100 obr./min na wstrząsie orbitalnej do OD₆₀₀ = 0,8-1,1.
2. Zmierz OD₆₀₀ kultury bakteryjnej i przygotuj pożywkę infekcyjną, rozcieńczając posiewkę bakteryjną w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) / 10% FCS (surowica cielęta płodu), aby osiągnąć pożądaną wielokrotność infekcji (MOI).
   UWAGA: Aby uzyskać wskaźnik zakażeń na poziomie 5-10% komórek HeLa, stosuje się MOI 10 000. Dla każdego typu komórek należy wykonać krzywą miareczki MOI, aby uzyskać optymalne wskaźniki zakażeń.
3. Wymień ośrodek transfekcyjny płytki z 384 dołkami na 50 μl podłoża zakaźnego za pomocą zautomatyzowanej podkładki płytowej.
4. Wiruj płytę z 384 dołkami w 400 x g i 4 °C przez 20 minut.
   UWAGA: Pomaga to zsynchronizować proces infekcji.
5. Zamknąć płytkę Parafilmem i inkubować na podgrzanej aluminiowej płycie w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%_CO2 przez 4 godziny.
6. Przemyj komórki DMEM/10% FCS zawierającym 100 μg/ml gm (gentamicyny), aby inaktywować bakterie zewnątrzkomórkowe, używając automatycznego myjnika płyt (użyj 200 μl/przelew studni).
   UWAGA: Podczas mycia przelewowego zautomatyzowana myjka płyt jednocześnie dozuje i zasysa medium.
7. Do testu wejściowego przepłucz komórki po raz drugi DMEM/10% FCS zawierającym 100 μg/ml gm i 100 ng/ml aTc, używając automatycznego mycia płytowego (użyj 200 μl/przelew studni).
8. Uszczelnij płytkę Parafilmem i przełóż ją na podgrzaną aluminiową płytkę w inkubatorze wilgotnym 37 °C z 5%_CO2 na kolejne 40 lub 4 godziny, odpowiednio do testu końcowego i wejściowego.
9. Aby utrwalić, płucz studnie PBS (sol fizjologiczna buforowana fosforanow) za pomocą zautomatyzowanej płuczki płytowej (użyj 200 μl/przelew odwiertu).
10. Wymień PBS z 50 μl 3,7% paraformaldehydu (PFA) w 0,2 M HEPES przy pH 7,4 za pomocą zautomatyzowanej myjki płytowej.
    UWAGA: Uwaga: PFA jest toksyczna przez wdychanie, kontakt ze skórą oraz po połknięciu.
11. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
12. Wymień medium fiksacyjne na 50 μl PBS za pomocą zautomatyzowanej podkładki płytowej.
    UWAGA: Próbki są już gotowe do wyjęcia z BSL3, jeśli zajdzie taka potrzeba.
    UWAGA: Pobranie dowolnej próbki z obiektu BSL3 (poziom bezpieczeństwa biologicznego 3) podlega ocenie ryzyka i walidacji procedury oraz zależy od obowiązujących przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

2. Barwienie

1. Płucz komórki dwukrotnie 50 μl PBS.
2. Przepuszczać komórki w 50 μl 0,1% Triton-X-100 w PBS przez 10 minut.
3. Płucz komórki trzy razy PBS. Dodaj 20 μl PBS zawierającego 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Umyj komórki trzy razy w PBS i chroń plamy przed światłem folią aluminiową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)	Fluka	22092
Siarczan kanamicyny	Sigma-Aldrich	60615
Butelka z nakrętką 250 ml	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Serum łydki płodu (FCS)	Gibco	10270	Inaktywacja termiczna
Płytka Greiner CELLSTAR z 384 dołkami	Sigma-Aldrich	M2062
Folia aluminiowa do odklejania	Costar	6570
Dozownik odczynników: "Multidrop 384 Reagent Dispenser"	Thermo Scientific	5840150	Można użyć alternatywnego dozownika odczynników.
Odczynnik transfekcyjny: "Lipofektamin RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automatyczna myjka płyt: "Podkładka płytowa ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Ta podkładka płytowa zawiera 16-kanałowy kolektor odpowiedni dla płyt z 384 otworami. Pasuje do szafki zabezpieczeń biologicznych i ma pokrywkę zakrywającą talerz podczas mycia, co zmniejsza ryzyko powstawania aerozolu. Można stosować alternatywne podkładki płytowe o podobnych cechach.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Rozpuszczać w buforze HEPES o stężeniu 0,2 m, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać świeżo dzień przed użyciem. Uwaga, PFA jest toksyczne przez wdychanie, kontakt ze skórą i po połknięcie.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
SiRNA Kif11	Dharmacon	L-003317-00
SIRNA ARPC3	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Urządzenia molekularne	IXM IMAGING MSCOPE	Zautomatyzowany mikroskop obrazujący komórkowy wyposażony w precyzyjny, zmotoryzowany stopień Z. Można stosować alternatywne systemy do mikroskopii automatycznej oraz alternatywne komponenty do twardych i oprogramowanych poniżej.