$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1.D2O włączenie leczenia w obecności antybiotyków (Rysunek 1a)
- Zmierz stężenie bakterii, mierząc gęstość optyczną (OD) fotometrem o długości fali 600 nm.
- Rozcieńcz roztwór bakteryjny za pomocą zwykłego pożywka bulionu Mueller-Hinton (MHB), który nie zawiera deuteru, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek 8 x 105 CFU /mL. Delikatnie wiruj, aby wymieszać komórki bakteryjne.
- Przygotuj 300 μL aliquotów roztworu bakteryjnego w siedmiu mikrotubkach o pojemności 1,5 mL oraz 600 μL aliquotów roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 mL.
- Dodaj 4,8 μL roztworu antybiotykowego (gentamicyny lub amoksycyliny) do mikrorurki zawierającej 600 μL roztworu bakteryjnego, aby uzyskać końcowe stężenie antybiotyku do 8 μg/mL.
- Pobierz 300 μL roztworu z 8 μg/mL roztworu bakterii zawierającego antybiotyk i dodaj do kolejnych 300 μL roztworu bakteryjnego, aby uzyskać dwukrotnie rozcieńczony roztwór bakterii zawierający antybiotyk (4 μg/mL).
- Powtórz dwukrotne rozcieńczenie antybiotyków, gentamicyny lub amoksycyliny, aż do osiągnięcia mikrorurki o najniższym stężeniu (0,25 μg/mL), i wyrzuć 300 μL z probówki. Zarówno dla gentamicyny, jak i amoksycyliny stężenia szeregowe wahają się od 0,25 μg/mL do 8 μg/mL.
- Zostaw jedną tubkę bez antybiotyków dla kontroli czystości. Będzie to pozytywna kontrola kontrolna badająca aktywność metaboliczną bakteryjnych bez leczenia antybiotykami, ale z leczeniemD2O.
- Zostaw jedną rurkę bez antybiotyków i bezD2Odo kontroli negatywnej.
- Inkubuj bakterię aliquot określonym antybiotykiem (gentamicyną lub amoksycyliną) zawierającym MHB przez 1 godzinę.
- Podczas inkubacji przygotować seryjne rozcieńczanie antybiotyków z podłożem zawierającym 100%D2Oo tym samym gradientie stężenia jak antybiotyki przygotowane w kroku 1.6. Zarówno dla gentamicyny, jak i amoksycyliny stężenia szeregowe wahają się od 0,25 μg/mL do 8 μg/mL.
- Po 1 godzinie leczenia antybiotykiem należy odpowiednio dodać 700 μL seryjnego rozcieńczonego antybiotyku i 100% podłoża MHB zawierającegoD2do 300 μL bakterii wcześniej obtraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu (przygotowanego w kroku 1.6).
- Na przykład dodaj 700 μL pożywki MHB zawierającej 100%D2O (zawierającej 8 μg/mL antybiotyku) do 300 μL preparatów antybiotykowych o stężeniu 300 μL bakterii wstępnie obtraktowanej antybiotykami. W ten sam sposób przenieś do odpowiednich probówek następnego stężenia i ujednolicaj przez pipetowanie w górę i w dół kilka razy.
- Dodaj 700 μL bezantybiotykowego medium MHB zawierającego 100%D2O do 300 μL bakterii wolnych od antybiotyków (przygotowanych w kroku 1.6.1) jako kontrolę bezantybiotykową.
- Inkubuj w temperaturze 37 °C w shakerze inkubacyjnym z prędkością 200 obr./min przez dodatkowe 30 minut.
UWAGA: W tym etapie końcowe stężenie D2Ow podłożu do testu wynosi 70%.
- Najpierw poddaj 1 ml antybiotyku iD2Opróbkę bakterii w dawce 6200 x g przez 5 minut w 4 °C, a następnie dwukrotnie przemyj oczyszczoną wodą. Na koniec utrwal próbki w roztworze 10% formacji formaliny i przechowywał je w temperaturze 4 °C.
2. obrazowanie stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) inkorporacji metabolicznejD2O w pojedynczej bakterii
- Przemyj 1 ml roztworu ustalonych bakterii wodą oczyszczoną, a następnie wiruj w 6200 x g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant. Wzbogać roztwór bakteryjny do około 20 μL.
- Roztwór bakteryjny nałóż na szkło pokrywkowe pokryte poli-L-lizyną. Kanapka i zapieczętowanie próbki do obrazowania SRS.
- Obrazuj bakterie z częstotliwością drgań C-D na 2168 cm-1 za pomocą mikroskopu SRS.
- Wprowadź i dostroj długość fali pompy do 852 nm za pomocą oprogramowania sterującego na komputerze.
- Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy. Ustaw moc lasera pompowego na próbce na ~8 mW, a moc lasera Stokesa na próbce na ~40 mW, regulując płytę półfalową przed wyjściem lasera.
UWAGA: W mikroskopie SRS regulowany laser femtosekundowy o częstotliwości powtórzeń 80 MHz zapewnia lasery wzbudzania pompy (680 do 1300 nm) oraz Stokesa (1045 nm).
- Poprzez regulację śrub luster odbiciowych przestrzennie wyrównuj pompę i wiązki Stokesa oraz kieruj obie wiązki do pionowego mikroskopu wyposażonego w system luster galvo 2D do skanowania laserowego.
- Użyj obiektywu zanurzania w wodzie 60x, aby skupić pompę i lasery Stokesa na próbce.
- Użyj skraplacza oleju, aby zebrać sygnały z próbki w kierunku przednim.
- Użyj filtra pasmowego, aby odfiltrować laser Stokesa przed skierowaniem go do fotodiody.
- Wyodrębnij pobudzony sygnał Ramana za pomocą wzmacniacza lock-in i wykryj sygnały za pomocą fotodiody.
- Ustaw każdy obraz SRS na 200 x 200 pikseli oraz czas zatrzymania pikseli na 30 μs w panelu sterowania oprogramowania. Całkowity czas akwizycji jednego obrazu wynosi ~1,2 s. Ustaw rozmiar kroku na 150 nm, tak aby rozmiar obrazu wynosił około 30 x 30 μm2. Zrób zdjęcia co najmniej trzech pól widzenia dla każdej próbki.